Published November 29, 2019
| Version v1
Publication
Open
Development and evaluation of a duplex TaqMan qPCR assay for detection and quantification of Trypanosoma cruzi infection in domestic and sylvatic reservoir hosts
Creators
- 1. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
- 2. Fundación Pro Salud y Medio Ambiente
- 3. Instituto Nacional de Salud Pública
- 4. Universidad de Los Andes
Description
A question of epidemiological relevance in Chagas disease studies is to understand Trypanosoma cruzi transmission cycles and trace the origins of (re)emerging cases in areas under vector or disease surveillance. Conventional parasitological methods lack sensitivity whereas molecular approaches can fill in this gap, provided that an adequate sample can be collected and processed and a nucleic acid amplification method can be developed and standardized. We developed a duplex qPCR assay for accurate detection and quantification of T. cruzi satellite DNA (satDNA) sequence in samples from domestic and sylvatic mammalian reservoirs. The method incorporates amplification of the gene encoding for the interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP), highly conserved among mammalian species, as endogenous internal amplification control (eIAC), allowing distinction of false negative PCR findings due to inadequate sample conditions, DNA degradation and/or PCR interfering substances.The novel TaqMan probe and corresponding primers employed in this study improved the analytical sensitivity of the assay to 0.01 par.eq/ml, greater than that attained by previous assays for Tc I and Tc IV strains. The assay was tested in 152 specimens, 35 from 15 different wild reservoir species and 117 from 7 domestic reservoir species, captured in endemic regions of Argentina, Colombia and Mexico and thus potentially infected with different parasite discrete typing units. The eIACs amplified in all samples from domestic reservoirs from Argentina and Mexico, such as Canis familiaris, Felis catus, Sus scrofa, Ovis aries, Equus caballus, Bos taurus and Capra hircus with quantification cycles (Cq's) between 23 and 25. Additionally, the eIACs amplified from samples obtained from wild mammals, such as small rodents Akodon toba, Galea leucoblephara, Rattus rattus, the opossums Didelphis virginiana, D. marsupialis and Marmosa murina, the bats Tadarida brasiliensis, Promops nasutus and Desmodus rotundus, as well as in Conepatus chinga, Lagostomus maximus, Leopardus geoffroyi, Lepus europaeus, Mazama gouazoubira and Lycalopex gymnocercus, rendering Cq's between 24 and 33.This duplex qPCR assay provides an accurate laboratory tool for screening and quantification of T. cruzi infection in a vast repertoire of domestic and wild mammalian reservoir species, contributing to improve molecular epidemiology studies of T. cruzi transmission cycles.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
تتمثل إحدى المسائل ذات الأهمية الوبائية في دراسات مرض شاغاس في فهم دورات انتقال المثقبيات الكروزية وتتبع أصول الحالات الناشئة (إعادة) في المناطق الخاضعة لمراقبة النواقل أو الأمراض. تفتقر الطرق الطفيلية التقليدية إلى الحساسية في حين أن الأساليب الجزيئية يمكن أن تسد هذه الفجوة، شريطة أنه يمكن جمع عينة كافية ومعالجتها ويمكن تطوير طريقة تضخيم الحمض النووي وتوحيدها. طورنا اختبار qPCR مزدوج للكشف الدقيق والقياس الكمي لتسلسل T. cruzi satellite DNA (satDNA) في عينات من خزانات الثدييات المحلية والحرجية. تتضمن الطريقة تضخيم ترميز الجينات لبروتين ربط الريتينويد بالمستقبلات البينية (IRBP)، المحفوظ بشكل كبير بين أنواع الثدييات، مثل التحكم الداخلي في التضخيم (eIAC)، مما يسمح بالتمييز بين نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل السلبية الكاذبة بسبب ظروف العينة غير الكافية، وتدهور الحمض النووي و/أو المواد المتداخلة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل. حسّن مسبار TaqMan الجديد والأشغال التمهيدية المقابلة المستخدمة في هذه الدراسة الحساسية التحليلية للمقايسة إلى 0.01 par.eq/ml، أكبر من تلك التي حققتها الاختبارات السابقة لسلالات Tc I و Tc IV. تم اختبار الاختبار على 152 عينة، 35 من 15 نوعًا مختلفًا من الخزانات البرية و 117 من 7 أنواع خزانات محلية، تم التقاطها في مناطق مستوطنة في الأرجنتين وكولومبيا والمكسيك، وبالتالي يحتمل أن تكون مصابة بوحدات كتابة مختلفة للطفيليات. تم تضخيم eIACs في جميع العينات من الخزانات المحلية من الأرجنتين والمكسيك، مثل Canis familiaris و Felis catus و Sus scrofa و Ovis aries و Equus caballus و Bos taurus و Capra hircus مع دورات القياس الكمي (Cq 's) بين 23 و 25. بالإضافة إلى ذلك، تم تضخيم eIACs من العينات التي تم الحصول عليها من الثدييات البرية، مثل القوارض الصغيرة Akodon toba و Galea leucoblephara و Rattus rattus و opossums Didelphis virginiana و D. marsupialis و Marmosa murina والخفافيش Tadarida brasiliensis و Promops nasutus و Desmodus rotundus، وكذلك في Conepatus chinga و Lagostomus maximus و Leopardus geoffroyi و Lepus europaeus و Mazama gouazoubira و Lycalopex gymnocercus، مما يجعل Cq بين 24 و 33. يوفر اختبار qPCR المزدوج هذا أداة مختبرية دقيقة لفحص وتحديد كمية عدوى T. cruzi في ذخيرة واسعة من أنواع الثدييات المحلية والبرية، مما يساهم في تحسين الدراسات الوبائية الجزيئية لدورات T. cruzi.Translated Description (French)
Une question de pertinence épidémiologique dans les études sur la maladie de Chagas est de comprendre les cycles de transmission du Trypanosoma cruzi et de retracer les origines des cas (ré)émergents dans les zones sous surveillance vectorielle ou pathologique. Les méthodes parasitologiques conventionnelles manquent de sensibilité alors que les approches moléculaires peuvent combler cette lacune, à condition qu'un échantillon adéquat puisse être collecté et traité et qu'une méthode d'amplification des acides nucléiques puisse être développée et normalisée. Nous avons développé un test qPCR duplex pour la détection et la quantification précises de la séquence d'ADN satellite (satDNA) de T. cruzi dans des échantillons de réservoirs de mammifères domestiques et sylvatiques. La méthode incorpore l'amplification du gène codant pour la protéine de liaison aux rétinoïdes interphotorécepteurs (IRBP), hautement conservée parmi les espèces de mammifères, en tant que contrôle d'amplification interne endogène (eIAC), permettant de distinguer les résultats de PCR faux négatifs en raison de conditions d'échantillon inadéquates, de la dégradation de l'ADN et/ou de substances interférant avec la PCR. La nouvelle sonde TaqMan et les amorces correspondantes utilisées dans cette étude ont amélioré la sensibilité analytique du test à 0,01 par.eq/ml, supérieure à celle atteinte par les tests précédents pour les souches Tc I et Tc IV. L'essai a été testé sur 152 spécimens, 35 provenant de 15 espèces réservoirs sauvages différentes et 117 provenant de 7 espèces réservoirs domestiques, capturés dans des régions endémiques d'Argentine, de Colombie et du Mexique et donc potentiellement infectés par différentes unités de typage distinctes de parasites. Les eIAC ont été amplifiés dans tous les échantillons de réservoirs domestiques d'Argentine et du Mexique, tels que Canis familiaris, Felis catus, Sus scrofa, Ovis aries, Equus caballus, Bos taurus et Capra hircus avec des cycles de quantification (Cq) entre 23 et 25. En outre, les eIAC amplifiés à partir d'échantillons obtenus à partir de mammifères sauvages, tels que les petits rongeurs Akodon toba, Galea leucoblephara, Rattus rattus, les opossums Didelphis virginiana, D. marsupialis et Marmosa murina, les chauves-souris Tadarida brasiliensis, Promops nasutus et Desmodus rotundus, ainsi que dans Conepatus chinga, Lagostomus maximus, Leopardus geoffroyi, Lepus europaeus, Mazama gouazoubira et Lycalopex gymnocercus, rendant les Cq entre 24 et 33. Ce test qPCR duplex fournit un outil de laboratoire précis pour le dépistage et la quantification de l'infection à T. cruzi dans un vaste répertoire d'espèces réservoirs de mammifères domestiques et sauvages, contribuant à améliorer les études d'épidémiologie moléculaire des cycles de transmission de T. cruzi.Translated Description (Spanish)
Una cuestión de relevancia epidemiológica en los estudios de la enfermedad de Chagas es comprender los ciclos de transmisión de Trypanosoma cruzi y rastrear los orígenes de los casos (re)emergentes en áreas bajo vigilancia de vectores o enfermedades. Los métodos parasitológicos convencionales carecen de sensibilidad, mientras que los enfoques moleculares pueden llenar este vacío, siempre que se pueda recolectar y procesar una muestra adecuada y se pueda desarrollar y estandarizar un método de amplificación de ácidos nucleicos. Desarrollamos un ensayo de qPCR dúplex para la detección y cuantificación precisas de la secuencia de ADN satelital de T. cruzi (ADN satelital) en muestras de reservorios de mamíferos domésticos y selváticos. El método incorpora la amplificación del gen que codifica la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP), altamente conservada entre las especies de mamíferos, como control de amplificación interno endógeno (eIAC), lo que permite distinguir los hallazgos de PCR falsos negativos debido a condiciones de muestra inadecuadas, degradación del ADN y/o sustancias que interfieren en la PCR. La nueva sonda TaqMan y los cebadores correspondientes empleados en este estudio mejoraron la sensibilidad analítica del ensayo a 0.01 par.eq/ml, mayor que la alcanzada por los ensayos anteriores para las cepas Tc I y Tc IV. El ensayo se probó en 152 especímenes, 35 de 15 especies de reservorios silvestres diferentes y 117 de 7 especies de reservorios domésticos, capturados en regiones endémicas de Argentina, Colombia y México y, por lo tanto, potencialmente infectados con diferentes unidades de tipificación discreta de parásitos. Los eIAC se amplificaron en todas las muestras de reservorios domésticos de Argentina y México, como Canis familiaris, Felis catus, Sus scrofa, Ovis aries, Equus caballus, Bos taurus y Capra hircus con ciclos de cuantificación (Cq 's) entre 23 y 25. Además, los eIAC se amplificaron a partir de muestras obtenidas de mamíferos silvestres, como pequeños roedores Akodon toba, Galea leucoblephara, Rattus rattus, las zarigüeyas Didelphis virginiana, D. marsupialis y Marmosa murina, los murciélagos Tadarida brasiliensis, Promops nasutus y Desmodus rotundus, así como en Conepatus chinga, Lagostomus maximus, Leopardus geoffroyi, Lepus europaeus, Mazama gouazoubira y Lycalopex gymnocercus, lo que hace que las Cq estén entre 24 y 33. Este ensayo de qPCR dúplex proporciona una herramienta de laboratorio precisa para el cribado y la cuantificación de la infección por T. cruzi en un amplio repertorio de especies de reservorios de mamíferos domésticos y silvestres, lo que contribuye a mejorar los estudios de epidemiología molecular de los ciclos de transmisión de T. cruzi.Files
s13071-019-3817-9.pdf
Files
(1.2 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:4f2938c98bdcee2b2df0dd125c4f62e5
|
1.2 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تطوير وتقييم اختبار TaqMan qPCR المزدوج للكشف عن عدوى المثقبية الكروزية وتحديد كميتها في مضيفات الخزان المنزلية والحرجية
- Translated title (French)
- Développement et évaluation d'un test duplex TaqMan qPCR pour la détection et la quantification de l'infection à Trypanosoma cruzi chez les hôtes réservoirs domestiques et sylvatiques
- Translated title (Spanish)
- Desarrollo y evaluación de un ensayo de qPCR TaqMan dúplex para la detección y cuantificación de la infección por Trypanosoma cruzi en huéspedes de reservorios domésticos y selváticos
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2991103178
- DOI
- 10.1186/s13071-019-3817-9
References
- https://openalex.org/W1901605865
- https://openalex.org/W2039031773
- https://openalex.org/W2059559625
- https://openalex.org/W2064216140
- https://openalex.org/W2066166179
- https://openalex.org/W2067223244
- https://openalex.org/W2068794323
- https://openalex.org/W2074596254
- https://openalex.org/W2090171658
- https://openalex.org/W2100230029
- https://openalex.org/W2104299647
- https://openalex.org/W2121652333
- https://openalex.org/W2144314296
- https://openalex.org/W2167972389
- https://openalex.org/W2331296272
- https://openalex.org/W2337509760
- https://openalex.org/W2348247963
- https://openalex.org/W235777296
- https://openalex.org/W2404066634
- https://openalex.org/W2598622203
- https://openalex.org/W2623108555
- https://openalex.org/W2779634601
- https://openalex.org/W35604236
- https://openalex.org/W4299960106
- https://openalex.org/W934430093
- https://openalex.org/W969843754