Published June 23, 2016 | Version v1
Publication Open

Optimization of Quantitative PCR Methods for Enteropathogen Detection

Creators

  • 1. University of Virginia
  • 2. Haydom Lutheran Hospital
  • 3. Kilimanjaro Christian Medical Centre
  • 4. Aga Khan University
  • 5. Armed Forces Research Institute of Medical Science
  • 6. International Centre for Diarrhoeal Disease Research
  • 7. Christian Medical College & Hospital

Description

Detection and quantification of enteropathogens in stool specimens is useful for diagnosing the cause of diarrhea but is technically challenging. Here we evaluate several important determinants of quantification: specimen collection, nucleic acid extraction, and extraction and amplification efficiency. First, we evaluate the molecular detection and quantification of pathogens in rectal swabs versus stool, using paired flocked rectal swabs and whole stool collected from 129 children hospitalized with diarrhea in Tanzania. Swabs generally yielded a higher quantification cycle (Cq) (average 29.7, standard deviation 3.5 vs. 25.3 ± 2.9 from stool, P<0.001) but were still able to detect 80% of pathogens with a Cq < 30 in stool. Second, a simplified total nucleic acid (TNA) extraction procedure was compared to separate DNA and RNA extractions and showed 92% (318/344) sensitivity and 98% (951/968) specificity, with no difference in Cq value for the positive results (ΔCq(DNA+RNA-TNA) = -0.01 ± 1.17, P = 0.972, N = 318). Third, we devised a quantification scheme that adjusts pathogen quantity to the specimen's extraction and amplification efficiency, and show that this better estimates the quantity of spiked specimens than the raw target Cq. In sum, these methods for enteropathogen quantification, stool sample collection, and nucleic acid extraction will be useful for laboratories studying enteric disease.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

يعد الكشف عن مسببات الأمراض المعوية وتحديد كميتها في عينات البراز مفيدًا لتشخيص سبب الإسهال ولكنه يمثل تحديًا تقنيًا. نقوم هنا بتقييم العديد من المحددات المهمة للقياس الكمي: جمع العينات، واستخراج الأحماض النووية، وكفاءة الاستخراج والتضخيم. أولاً، نقوم بتقييم الكشف الجزيئي والتقدير الكمي لمسببات الأمراض في مسحات المستقيم مقابل البراز، باستخدام مسحات المستقيم المتدفقة المقترنة والبراز الكامل الذي تم جمعه من 129 طفلاً في المستشفى يعانون من الإسهال في تنزانيا. أسفرت المسحات عمومًا عن دورة تقدير كمي أعلى (Cq) (متوسط 29.7، انحراف معياري 3.5 مقابل 25.3 ± 2.9 من البراز، P<0.001) لكنها كانت لا تزال قادرة على اكتشاف 80 ٪ من مسببات الأمراض مع Cq < 30 في البراز. ثانيًا، تمت مقارنة إجراء استخراج الحمض النووي الكلي المبسط (TNA) باستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي المنفصلين وأظهر 92 ٪ (318/344) حساسية و 98 ٪ (951/968) خصوصية، مع عدم وجود فرق في قيمة Cq للنتائج الإيجابية (ΔCq (DNA+ RNA - TNA) = -0.01 ± 1.17، P = 0.972، N = 318). ثالثًا، ابتكرنا مخططًا كميًا يضبط كمية مسببات الأمراض وفقًا لكفاءة استخراج العينة وتضخيمها، ويظهر أن هذا يقدر كمية العينات المسننة بشكل أفضل من الهدف الخام Cq. باختصار، ستكون هذه الطرق للقياس الكمي لمسببات الأمراض المعوية، وجمع عينات البراز، واستخراج الأحماض النووية مفيدة للمختبرات التي تدرس الأمراض المعوية.

Translated Description (French)

La détection et la quantification des entéropathogènes dans les échantillons de selles sont utiles pour diagnostiquer la cause de la diarrhée, mais elles sont techniquement difficiles. Nous évaluons ici plusieurs déterminants importants de la quantification : la collecte des échantillons, l'extraction des acides nucléiques et l'efficacité de l'extraction et de l'amplification. Tout d'abord, nous évaluons la détection moléculaire et la quantification des agents pathogènes dans les écouvillons rectaux par rapport aux selles, en utilisant des écouvillons rectaux groupés et des selles entières prélevés sur 129 enfants hospitalisés pour diarrhée en Tanzanie. Les écouvillons ont généralement donné un cycle de quantification (Cq) plus élevé (moyenne 29,7, écart type 3,5 vs 25,3 ± 2,9 par rapport aux selles, P<0,001), mais étaient toujours capables de détecter 80 % des agents pathogènes avec une Cq < 30 dans les selles. Deuxièmement, une procédure simplifiée d'extraction d'acide nucléique total (TNA) a été comparée à des extractions séparées d'ADN et d'ARN et a montré une sensibilité de 92% (318/344) et une spécificité de 98% (951/968), sans différence de valeur de Cq pour les résultats positifs (ΔCq (ADN+ ARN-TNA) = -0,01 ± 1,17, P = 0,972, N = 318). Troisièmement, nous avons conçu un schéma de quantification qui ajuste la quantité d'agents pathogènes à l'efficacité d'extraction et d'amplification de l'échantillon et montre que cela estime mieux la quantité d'échantillons enrichis que le Cq cible brut. En somme, ces méthodes de quantification des entéropathogènes, de collecte d'échantillons de selles et d'extraction d'acides nucléiques seront utiles pour les laboratoires qui étudient les maladies entériques.

Translated Description (Spanish)

La detección y cuantificación de enteropatógenos en muestras de heces es útil para diagnosticar la causa de la diarrea, pero técnicamente es un desafío. Aquí evaluamos varios determinantes importantes de la cuantificación: recolección de muestras, extracción de ácidos nucleicos y eficiencia de extracción y amplificación. En primer lugar, evaluamos la detección molecular y la cuantificación de patógenos en hisopos rectales versus heces, utilizando hisopos rectales agrupados emparejados y heces enteras recolectadas de 129 niños hospitalizados con diarrea en Tanzania. Los hisopos generalmente produjeron un ciclo de cuantificación (Cq) más alto (media 29,7, desviación estándar 3,5 frente a 25,3 ± 2,9 de las heces, P<0,001), pero aún así fueron capaces de detectar el 80% de los patógenos con una Cq < 30 en las heces. En segundo lugar, se comparó un procedimiento simplificado de extracción de ácido nucleico total (TNA) con extracciones separadas de ADN y ARN y mostró una sensibilidad del 92% (318/344) y una especificidad del 98% (951/968), sin diferencias en el valor de Cq para los resultados positivos (ΔCq (ADN+ ARN-TNA) = -0,01 ± 1,17, P = 0,972, N = 318). En tercer lugar, diseñamos un esquema de cuantificación que ajusta la cantidad de patógenos a la eficiencia de extracción y amplificación del espécimen, y mostramos que esto estima mejor la cantidad de especímenes enriquecidos que el Cq objetivo sin procesar. En resumen, estos métodos para la cuantificación de enteropatógenos, la recolección de muestras de heces y la extracción de ácidos nucleicos serán útiles para los laboratorios que estudian enfermedades entéricas.

Files

journal.pone.0158199&type=printable.pdf

Files (323.2 kB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:f8615614bf4a7cdd947c037051c38ae9
323.2 kB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تحسين طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية للكشف عن مسببات الأمراض المعوية
Translated title (French)
Optimisation des méthodes quantitatives de PCR pour la détection des entéropathogènes
Translated title (Spanish)
Optimización de los métodos de PCR cuantitativa para la detección de enteropatógenos

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2460389469
DOI
10.1371/journal.pone.0158199

Is supplement to
https://openalex.org/W633173308 (Other)
https://openalex.org/W3004967179 (Other)
https://openalex.org/W2802691951 (Other)
https://openalex.org/W2383750441 (Other)
https://openalex.org/W2135990064 (Other)
https://openalex.org/W2085406081 (Other)
https://openalex.org/W2061946247 (Other)
https://openalex.org/W1971444612 (Other)
https://openalex.org/W1572021523 (Other)
https://openalex.org/W1543504406 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
Bangladesh

References

  • https://openalex.org/W1731548184
  • https://openalex.org/W1969330226
  • https://openalex.org/W1980784287
  • https://openalex.org/W2014429132
  • https://openalex.org/W2016364046
  • https://openalex.org/W2028140592
  • https://openalex.org/W2036036778
  • https://openalex.org/W2044875822
  • https://openalex.org/W2078497184
  • https://openalex.org/W2088976222
  • https://openalex.org/W2113235881
  • https://openalex.org/W2114053580
  • https://openalex.org/W2122973465
  • https://openalex.org/W2142186063
  • https://openalex.org/W2142662767
  • https://openalex.org/W2150169200
  • https://openalex.org/W2151437043
  • https://openalex.org/W2153522309
  • https://openalex.org/W2167021159
  • https://openalex.org/W2170774926