Published June 6, 2022 | Version v1
Publication Open

Development and Application of a Duplex Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for Detection and Differentiation of EP402R-Deleted and Wild-Type African Swine Fever Virus

Creators

  • 1. National Development and Reform Commission
  • 2. Ministry of Agriculture and Rural Affairs
  • 3. Key Laboratory of Guangdong Province
  • 4. South China Agricultural University

Description

African swine fever (ASF) is a highly fatal porcine disease caused by the African swine fever virus (ASFV), and resulting in huge economic losses across the globe. ASF has been raging in China for 3 years, and recently EP402R-deleted ASFV strains emerged, showing sub-acute or chronic symptoms in pigs and providing novel difficulties to monitor and control the disease as EP402R-deleted strains possess no hemadsorption (HAD) ability. In addition, the gene deletion virus with low viral load is prone to results retest or false negative due to the high cycle threshold (Ct) value under the current real-time polymerase chain reaction (PCR) detection method. Thus, a new method is needed to detect and distinguish wild strains and gene-deleted viruses. In this study, a duplex droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) assay based on the ASFV B646L and EP402R genes was established and showed good linearity (R2 > 0.99). The limit of detection for duplex ddPCR was 52 copies per reaction and 8.6 copies per reaction for B646L and EP402R, respectively. No cross-reaction with other porcine viruses [classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), porcine parvovirus (PPV), Japanese encephalitis virus (JEV), and porcine circovirus type 2 (PCV2)] was identified by this assay. In addition, 44 ASFV-suspicious clinical samples as well as EP402R-deleted ASFV were tested in parallel by duplex real-time PCR and ddPCR, indicative of a higher sensitivity which belonged to the duplex ddPCR assay. In summary, this is the first time that duplex ddPCR assay has been successfully developed to provide an efficient method to detect and differentiate ASFV wild-type and gene-deleted strains.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

حمى الخنازير الأفريقية (ASF) هي مرض خنازير قاتل للغاية يسببه فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV)، ويؤدي إلى خسائر اقتصادية هائلة في جميع أنحاء العالم. احتدم مرض التهاب الفقار الروماتويدي في الصين لمدة 3 سنوات، وظهرت مؤخرًا سلالات التهاب الفقار الروماتويدي ASFV المحذوفة من EP402R، والتي تظهر أعراضًا شبه حادة أو مزمنة لدى الخنازير وتسبب صعوبات جديدة في مراقبة المرض والسيطرة عليه حيث لا تمتلك السلالات المحذوفة من EP402R أي قدرة على الامتصاص الدموي. بالإضافة إلى ذلك، فإن فيروس حذف الجينات ذو الحمل الفيروسي المنخفض عرضة لإعادة اختبار النتائج أو سلبية كاذبة بسبب قيمة عتبة الدورة العالية (CT) بموجب طريقة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) الحالية. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة جديدة للكشف عن السلالات البرية والفيروسات المحذوفة من الجينات والتمييز بينها. في هذه الدراسة، تم إنشاء اختبار تفاعل البوليميراز الرقمي المزدوج (ddPCR) بناءً على جينات ASFV B646L و EP402R وأظهر خطية جيدة (R2 > 0.99). كان حد الكشف عن ddPCR على الوجهين 52 نسخة لكل تفاعل و 8.6 نسخة لكل تفاعل لـ B646L و EP402R، على التوالي. لم يتم تحديد أي تفاعل متقاطع مع فيروسات الخنازير الأخرى [فيروس حمى الخنازير الكلاسيكية (CSFV)، وفيروس متلازمة الخنازير التناسلية والتنفسية (PRRSV)، وفيروس الإسهال الوبائي الخنازير (PEDV)، والفيروس الصغير الخنازير (PPV)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)، والفيروس الدائري الخنازير من النوع 2 (PCV2)] من خلال هذا الفحص. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار 44 عينة سريرية مشبوهة من ASFV بالإضافة إلى ASFV المحذوفة من EP402R بالتوازي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على الوجهين و ddPCR، مما يدل على حساسية أعلى تنتمي إلى اختبار ddPCR على الوجهين. باختصار، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تطوير اختبار ddPCR على الوجهين بنجاح لتوفير طريقة فعالة لاكتشاف وتمييز سلالات ASFV البرية والسلالات المحذوفة من الجينات.

Translated Description (French)

La peste porcine africaine (PPA) est une maladie porcine hautement mortelle causée par le virus de la peste porcine africaine (VPA) et entraînant d'énormes pertes économiques dans le monde entier. La PPA fait rage en Chine depuis 3 ans, et des souches d'ASFV effacées de l'EP402R ont récemment émergé, montrant des symptômes sous-aiguës ou chroniques chez les porcs et fournissant de nouvelles difficultés pour surveiller et contrôler la maladie car les souches effacées de l'EP402R ne possèdent aucune capacité d'hémadsorption (HAD). En outre, le virus de délétion de gène à faible charge virale est sujet à des résultats de retest ou à des faux négatifs en raison de la valeur de seuil de cycle (Ct) élevée dans le cadre de la méthode actuelle de détection par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en temps réel. Ainsi, une nouvelle méthode est nécessaire pour détecter et distinguer les souches sauvages et les virus à gènes supprimés. Dans cette étude, un test de réaction en chaîne de la polymérase numérique en gouttelettes duplex (ddPCR) basé sur les gènes ASFV B646L et EP402R a été établi et a montré une bonne linéarité (R2 > 0,99). La limite de détection pour la ddPCR duplex était de 52 copies par réaction et de 8,6 copies par réaction pour B646L et EP402R, respectivement. Aucune réaction croisée avec d'autres virus porcins [virus de la peste porcine classique (CSFV), virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV), virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV), parvovirus porcin (PPV), virus de l'encéphalite japonaise (JEV) et circovirus porcin de type 2 (PCV2)] n'a été identifiée par ce test. En outre, 44 échantillons cliniques suspects d'ASFV ainsi que des ASFV supprimés de l'EP402R ont été testés en parallèle par PCR en temps réel en duplex et ddPCR, indiquant une sensibilité plus élevée qui appartenait au test ddPCR en duplex. En résumé, c'est la première fois que le test duplex ddPCR a été développé avec succès pour fournir une méthode efficace de détection et de différenciation des souches de type sauvage et à gènes supprimés de l'ASFV.

Translated Description (Spanish)

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad porcina altamente mortal causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA) y que provoca enormes pérdidas económicas en todo el mundo. La PPA ha estado haciendo estragos en China durante 3 años, y recientemente surgieron cepas de ASFV con deleción de EP402R, que muestran síntomas subagudos o crónicos en cerdos y proporcionan nuevas dificultades para monitorear y controlar la enfermedad, ya que las cepas con deleción de EP402R no poseen capacidad de hemadsorción (HAD). Además, el virus de deleción génica con baja carga viral es propenso a la repetición de la prueba de resultados o falsos negativos debido al valor de umbral de ciclo alto (Ct) bajo el método actual de detección de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Por lo tanto, se necesita un nuevo método para detectar y distinguir cepas silvestres y virus con genes eliminados. En este estudio, se estableció un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas dúplex (ddPCR) basado en los genes ASFV B646L y EP402R y mostró una buena linealidad (R2 > 0,99). El límite de detección para ddPCR dúplex fue de 52 copias por reacción y 8.6 copias por reacción para B646L y EP402R, respectivamente. Este ensayo no identificó ninguna reacción cruzada con otros virus porcinos [virus de la peste porcina clásica (VPPC), virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), parvovirus porcino (PPV), virus de la encefalitis japonesa (JEV) y circovirus porcino tipo 2 (PCV2)]. Además, 44 muestras clínicas sospechosas de ASFV, así como ASFV con deleción de EP402R, se probaron en paralelo mediante PCR en tiempo real dúplex y ddPCR, lo que indica una mayor sensibilidad que pertenecía al ensayo ddPCR dúplex. En resumen, esta es la primera vez que el ensayo dúplex ddPCR se ha desarrollado con éxito para proporcionar un método eficiente para detectar y diferenciar las cepas de ASFV de tipo salvaje y con genes eliminados.

Files

pdf.pdf

Files (2.5 MB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:58d22e9956bcb8607ea6ee559fa6777a
2.5 MB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تطوير وتطبيق اختبار تفاعل البوليميراز الرقمي المزدوج للكشف عن فيروس حمى الخنازير الأفريقية المحذوف EP402R والنوع البري والتمايز بينهما
Translated title (French)
Développement et application d'un test de réaction en chaîne par polymérase numérique à gouttelettes duplex pour la détection et la différenciation du virus de la peste porcine africaine de type EP402R supprimé et sauvage
Translated title (Spanish)
Desarrollo y aplicación de un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas dúplex para la detección y diferenciación del virus de la peste porcina africana de tipo salvaje y eliminado de EP402R

Identifiers

Other
https://openalex.org/W4281608676
DOI
10.3389/fvets.2022.905706

Is supplement to
https://openalex.org/W4293564851 (Other)
https://openalex.org/W4285048397 (Other)
https://openalex.org/W4221105036 (Other)
https://openalex.org/W3205440159 (Other)
https://openalex.org/W278568090 (Other)
https://openalex.org/W2377041804 (Other)
https://openalex.org/W2357221062 (Other)
https://openalex.org/W2356797751 (Other)
https://openalex.org/W2013629471 (Other)
https://openalex.org/W1994523665 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
China

References

  • https://openalex.org/W2113559596
  • https://openalex.org/W2515986932
  • https://openalex.org/W2600476130
  • https://openalex.org/W2750227535
  • https://openalex.org/W2887875179
  • https://openalex.org/W2923687374
  • https://openalex.org/W2955635870
  • https://openalex.org/W2970934996
  • https://openalex.org/W2981124349
  • https://openalex.org/W2984362742
  • https://openalex.org/W2998393392
  • https://openalex.org/W3006471840
  • https://openalex.org/W3009223043
  • https://openalex.org/W3018245422
  • https://openalex.org/W3025280172
  • https://openalex.org/W3043866022
  • https://openalex.org/W3091882843
  • https://openalex.org/W3098940183
  • https://openalex.org/W3111526228
  • https://openalex.org/W3128049022
  • https://openalex.org/W3134004139
  • https://openalex.org/W3136008479
  • https://openalex.org/W3139022760
  • https://openalex.org/W3144882856
  • https://openalex.org/W3160861960
  • https://openalex.org/W3164837141
  • https://openalex.org/W3174279433
  • https://openalex.org/W3177407679
  • https://openalex.org/W3216743555
  • https://openalex.org/W4226250074