Published February 1, 2015 | Version v1
Publication Open

Construction and characterization of recombinant human adenovirus type 5 expressing foot-and-mouth disease virus capsid proteins of Indian vaccine strain, O/IND/R2/75

Creators

  • 1. Indian Veterinary Research Institute

Description

Generation of recombinant human adenovirus type 5 expressing foot-and-mouth disease virus (FMDV) capsid protein genes along with full-length 2B, 3B and 3C(pro) and its characterization.FMD viral RNA isolation, cDNA synthesis, and polymerase chain reaction were performed to synthesize expression cassettes (P1-2AB3BC(wt) and P1-2AB3BC(m)) followed by cloning in pShuttle-CMV vector. Chemically competent BJ5183-AD-1 cells were transformed with the recombinant pShuttle-CMV to produce recombinant adenoviral plasmids. HEK-293 cells were transfected with the recombinant adenoviral plasmids to generate recombinant adenoviruses (hAd5/P1-2AB3BC(wt) and hAd5/P1-2AB3BC(m)). Expression of the target proteins was analyzed by sandwich ELISA and indirect immunofluorescence assay. The recombinant adenoviruses were purified and concentrated by CsCl density gradient ultracentrifugation. Growth kinetics and thermostability of the recombinant adenoviruses were compared with that of non-recombinant replication-defective adenovirus (dAd5).The recombinant adenoviruses containing capsid protein genes of the FMDV O/IND/R2/75 were generated and amplified in HEK-293 cells. The titer of the recombinant adenoviruses was approximately 10(8), 10(9.5) and 10(11) TCID50/ml in supernatant media, cell lysate and CsCl purified preparation, respectively. Expression of the FMDV capsid protein was detectable in sandwich ELISA and confirmed by immunofluorescence assay. Growth kinetics of the recombinant adenoviruses did not reveal a significant difference when compared with that of dAd5. A decrement of up to 10-fold at 4°C and 21-fold at 37°C was recorded in the virus titers during 60 h incubation period and found to be statistically significant (p<0.01).Recombinant adenoviruses expressing capsid proteins of the FMDV O/IND/R2/75 were constructed and produced in high titers. In vitro expression of the target proteins in the adenovirus vector system was detected by sandwich ELISA and immunofluorescence assay.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

توليد الفيروس الغدي البشري المؤتلف من النوع 5 الذي يعبر عن جينات البروتين القفيصي لفيروس الحمى القلاعية (FMDV) جنبًا إلى جنب مع 2B و 3B و 3C (PRO) كامل الطول وتوصيفه. تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي FMD وتخليق الحمض النووي الريبي وتفاعل سلسلة البلمرة لتوليف أشرطة التعبير (P1-2AB3BC (بالوزن) و P1-2AB3BC (m)) متبوعة بالاستنساخ في ناقل pShuttle - CMV. تم تحويل خلايا BJ5183 - AD -1 المؤهلة كيميائيًا باستخدام pShuttle - CMV المؤتلف لإنتاج بلازميدات الفيروس الغدي المؤتلف. تم نقل خلايا HEK -293 مع بلازميدات الفيروس الغدي المؤتلف لتوليد فيروسات غدية مؤتلفة (hAd5/P1-2AB3BC (بالوزن) و hAd5/P1-2AB3BC (m)). تم تحليل التعبير عن البروتينات المستهدفة عن طريق اختبار ELISA الشطيري ومقايسة التألق المناعي غير المباشرة. تمت تنقية الفيروسات الغدية المؤتلفة وتركيزها بواسطة الطرد المركزي فائق التدرج لكثافة CsCl. تمت مقارنة حركية النمو ودرجة حرارة الفيروسات الغدية المؤتلفة مع تلك الخاصة بالفيروس الغدي المعيب للتكاثر غير المؤتلف (dAd5). تم توليد وتضخيم الفيروسات الغدية المؤتلفة التي تحتوي على جينات بروتين القفيصة لـ FMDV O/IND/R2/75 في خلايا HEK -293. كان عيار الفيروسات الغدية المؤتلفة حوالي 10(8) و 10(9.5) و 10(11) TCID50/ml في الوسائط الطافية، محللات الخلايا وتحضير CsCl المنقى، على التوالي. كان التعبير عن بروتين قفيصة FMDV قابلاً للاكتشاف في شطيرة ELISA وتم تأكيده بواسطة اختبار التألق المناعي. لم تكشف حركيات النمو للفيروسات الغدية المؤتلفة عن اختلاف كبير عند مقارنتها بالفيروس dAd5. تم تسجيل انخفاض يصل إلى 10 أضعاف عند 4 درجات مئوية و 21 ضعفًا عند 37 درجة مئوية في عيار الفيروس خلال فترة حضانة 60 ساعة ووجد أنها ذات دلالة إحصائية (p<0.01). تم بناء وإنتاج فيروسات غدية مؤتلفة تعبر عن بروتينات القفيصة لـ FMDV O/IND/R2/75 في عيار عالي. تم الكشف عن التعبير المختبري للبروتينات المستهدفة في نظام ناقلات الفيروس الغدي عن طريق اختبار ELISA الشطيري ومقايسة التألق المناعي.

Translated Description (French)

Génération d'adénovirus humain recombinant de type 5 exprimant les gènes de la protéine de capside du virus de la fièvre aphteuse (FMDV) ainsi que 2B, 3B et 3C(pro) pleine longueur et sa caractérisation. L'isolement de l'ARN viral FMD, la synthèse de l'ADNc et la réaction en chaîne de la polymérase ont été effectués pour synthétiser les cassettes d'expression (P1-2AB3BC (wt) et P1-2AB3BC (m)) suivies du clonage dans le vecteur pShuttle-CMV. Des cellules BJ5183-AD-1 chimiquement compétentes ont été transformées avec le pShuttle-CMV recombinant pour produire des plasmides adénoviraux recombinants. Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec les plasmides adénoviraux recombinants pour générer des adénovirus recombinants (hAd5/P1-2AB3BC (wt) et hAd5/P1-2AB3BC(m)). L'expression des protéines cibles a été analysée par ELISA sandwich et dosage par immunofluorescence indirecte. Les adénovirus recombinants ont été purifiés et concentrés par ultracentrifugation à gradient de densité CsCl. La cinétique de croissance et la thermostabilité des adénovirus recombinants ont été comparées à celle de l'adénovirus défectif pour la réplication non recombinante (dAd5). Les adénovirus recombinants contenant les gènes de la protéine de capside du FMDV O/IND/R2/75 ont été générés et amplifiés dans les cellules HEK-293. Le titre des adénovirus recombinants était d'environ 10(8), 10(9.5) et 10(11) TCID50/ml dans les milieux surnageants, le lysat cellulaire et la préparation purifiée au CsCl, respectivement. L'expression de la protéine de capside du FMDV était détectable en ELISA sandwich et confirmée par un test d'immunofluorescence. La cinétique de croissance des adénovirus recombinants n'a pas révélé de différence significative par rapport à celle de dAd5. Une décrémentation allant jusqu'à 10 fois à 4°C et 21 fois à 37°C a été enregistrée dans les titres viraux pendant la période d'incubation de 60 h et s'est révélée statistiquement significative (p<0,01). Des adénovirus recombinants exprimant les protéines de capside du FMDV O/IND/R2/75 ont été construits et produits en titres élevés. L'expression in vitro des protéines cibles dans le système vecteur d'adénovirus a été détectée par ELISA sandwich et dosage par immunofluorescence.

Translated Description (Spanish)

Generación de adenovirus humano recombinante tipo 5 que expresa genes de proteína de la cápside del virus de la fiebre aftosa (FMDV) junto con 2B, 3B y 3C(pro) de longitud completa y su caracterización. Se realizaron aislamiento de ARN viral FMD, síntesis de ADNc y reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar casetes de expresión (P1-2AB3BC (wt) y P1-2AB3BC (m)) seguido de clonación en vector pShuttle-CMV. Se transformaron células BJ5183-AD-1 químicamente competentes con el pShuttle-CMV recombinante para producir plásmidos adenovirales recombinantes. Las células HEK-293 se transfectaron con los plásmidos adenovirales recombinantes para generar adenovirus recombinantes (hAd5/P1-2AB3BC(wt) y hAd5/P1-2AB3BC(m)). La expresión de las proteínas diana se analizó mediante ELISA de sándwich y ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Los adenovirus recombinantes se purificaron y concentraron mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de CsCl. La cinética de crecimiento y la termoestabilidad de los adenovirus recombinantes se compararon con la de los adenovirus de replicación defectuosa no recombinantes (dAd5). Los adenovirus recombinantes que contienen genes de proteínas de la cápside del FMDV O/IND/R2/75 se generaron y amplificaron en células HEK-293. El título de los adenovirus recombinantes fue de aproximadamente 10(8), 10(9.5) y 10(11) TCID50/ml en medio sobrenadante, lisado celular y preparación purificada con CsCl, respectivamente. La expresión de la proteína de la cápside de FMDV fue detectable en ELISA sándwich y se confirmó mediante ensayo de inmunofluorescencia. La cinética de crecimiento de los adenovirus recombinantes no reveló una diferencia significativa en comparación con la de dAd5. Se registró una disminución de hasta 10 veces a 4 ° C y 21 veces a 37 ° C en los títulos de virus durante un período de incubación de 60 h y se encontró que era estadísticamente significativo (p<0.01). Los adenovirus recombinantes que expresan proteínas de la cápside del FMDV O/IND/R2/75 se construyeron y produjeron en títulos altos. La expresión in vitro de las proteínas diana en el sistema de vector de adenovirus se detectó mediante ELISA sándwich y ensayo de inmunofluorescencia.

Files

4.pdf.pdf

Files (226 Bytes)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:5360980bad11bf9723da89687501effc
226 Bytes
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
بناء وتوصيف الفيروس الغدي البشري المؤتلف من النوع 5 الذي يعبر عن بروتينات قفيصة فيروس الحمى القلاعية لسلالة اللقاح الهندي، O/IND/R2/75
Translated title (French)
Construction et caractérisation de l'adénovirus humain recombinant de type 5 exprimant les protéines de capside du virus de la fièvre aphteuse de souche vaccinale indienne, O/IND/R2/75
Translated title (Spanish)
Construcción y caracterización de adenovirus humano recombinante tipo 5 que expresa proteínas de la cápside del virus de la fiebre aftosa de la cepa de vacuna de la India, O/IND/R2/75

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2149122889
DOI
10.14202/vetworld.2015.147-155

Is supplement to
https://openalex.org/W4316495397 (Other)
https://openalex.org/W3028866077 (Other)
https://openalex.org/W2968050865 (Other)
https://openalex.org/W2900897541 (Other)
https://openalex.org/W2769051567 (Other)
https://openalex.org/W2347733161 (Other)
https://openalex.org/W2169851782 (Other)
https://openalex.org/W2137572138 (Other)
https://openalex.org/W2079290149 (Other)
https://openalex.org/W2076921277 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
India

References

  • https://openalex.org/W1426238050
  • https://openalex.org/W1494208496
  • https://openalex.org/W1720930918
  • https://openalex.org/W1965403344
  • https://openalex.org/W1966003144
  • https://openalex.org/W1966990229
  • https://openalex.org/W1970701907
  • https://openalex.org/W1982712041
  • https://openalex.org/W1985766090
  • https://openalex.org/W1987519563
  • https://openalex.org/W1991457448
  • https://openalex.org/W2004531038
  • https://openalex.org/W2004736524
  • https://openalex.org/W2006617026
  • https://openalex.org/W2009126191
  • https://openalex.org/W2012687768
  • https://openalex.org/W2014774026
  • https://openalex.org/W2015035237
  • https://openalex.org/W2020792961
  • https://openalex.org/W2028668632
  • https://openalex.org/W2046117249
  • https://openalex.org/W2047678524
  • https://openalex.org/W2047784030
  • https://openalex.org/W2072206210
  • https://openalex.org/W2076621213
  • https://openalex.org/W2076708252
  • https://openalex.org/W2082708750
  • https://openalex.org/W2103738533
  • https://openalex.org/W2107315188
  • https://openalex.org/W2120321866
  • https://openalex.org/W2125454666
  • https://openalex.org/W2135165936
  • https://openalex.org/W2135588146
  • https://openalex.org/W2138479150
  • https://openalex.org/W2143238921
  • https://openalex.org/W2158744232
  • https://openalex.org/W2463469805