Published July 21, 2016
| Version v1
Publication
Open
In Silico Design and Experimental Validation of siRNAs Targeting Conserved Regions of Multiple Hepatitis C Virus Genotypes
Creators
- 1. American University in Cairo
- 2. Nile University
- 3. National Research Centre
- 4. Institut Pasteur Korea
- 5. Theodor Bilharz Research Institute
- 6. Misr University for Science and Technology
Description
RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing mechanism that mediates the sequence-specific degradation of targeted RNA and thus provides a tremendous opportunity for development of oligonucleotide-based drugs. Here, we report on the design and validation of small interfering RNAs (siRNAs) targeting highly conserved regions of the hepatitis C virus (HCV) genome. To aim for therapeutic applications by optimizing the RNAi efficacy and reducing potential side effects, we considered different factors such as target RNA variations, thermodynamics and accessibility of the siRNA and target RNA, and off-target effects. This aim was achieved using an in silico design and selection protocol complemented by an automated MysiRNA-Designer pipeline. The protocol included the design and filtration of siRNAs targeting highly conserved and accessible regions within the HCV internal ribosome entry site, and adjacent core sequences of the viral genome with high-ranking efficacy scores. Off-target analysis excluded siRNAs with potential binding to human mRNAs. Under this strict selection process, two siRNAs (HCV353 and HCV258) were selected based on their predicted high specificity and potency. These siRNAs were tested for antiviral efficacy in HCV genotype 1 and 2 replicon cell lines. Both in silico-designed siRNAs efficiently inhibited HCV RNA replication, even at low concentrations and for short exposure times (24h); they also exceeded the antiviral potencies of reference siRNAs targeting HCV. Furthermore, HCV353 and HCV258 siRNAs also inhibited replication of patient-derived HCV genotype 4 isolates in infected Huh-7 cells. Prolonged treatment of HCV replicon cells with HCV353 did not result in the appearance of escape mutant viruses. Taken together, these results reveal the accuracy and strength of our integrated siRNA design and selection protocols. These protocols could be used to design highly potent and specific RNAi-based therapeutic oligonucleotide interventions.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو آلية إسكات الجينات بعد النسخ التي تتوسط التحلل الخاص بالتسلسل للحمض النووي الريبي المستهدف، وبالتالي توفر فرصة هائلة لتطوير الأدوية القائمة على أوليجو نوكليوتيد. هنا، نبلغ عن تصميم والتحقق من صحة الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) الذي يستهدف المناطق المحفوظة للغاية من جينوم فيروس التهاب الكبد الوبائي (HCV). بهدف التطبيقات العلاجية من خلال تحسين فعالية الحمض النووي الريبوزي والحد من الآثار الجانبية المحتملة، نظرنا في عوامل مختلفة مثل اختلافات الحمض النووي الريبوزي المستهدف، والديناميكا الحرارية وإمكانية الوصول إلى الحمض النووي الريبوزي السيرنا والحمض النووي الريبوزي المستهدف، والآثار غير المستهدفة. وقد تحقق هذا الهدف باستخدام بروتوكول تصميم واختيار سيليكو يكمله خط أنابيب MysiRNA - Designer الآلي. تضمن البروتوكول تصميم وترشيح siRNAs التي تستهدف المناطق المحفوظة للغاية والتي يمكن الوصول إليها داخل موقع دخول الريبوسوم الداخلي لـ HCV، والمتواليات الأساسية المجاورة للجينوم الفيروسي مع درجات فعالية عالية المستوى. استبعد التحليل خارج الهدف الحمض النووي الريبوزي المنقوص الأكسجين (siRNAs) مع احتمال الارتباط بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (mRNAs) في إطار عملية الاختيار الصارمة هذه، تم اختيار اثنين من siRNAs (HCV353 و HCV258) بناءً على خصوصيتهما العالية المتوقعة وفعاليتهما. تم اختبار هذه siRNAs للفعالية المضادة للفيروسات في النمط الجيني HCV 1 و 2 خطوط الخلايا المتماثلة. في كل من siRNAs المصممة بالسيليكو، تم تثبيط تكرار الحمض النووي الريبي لـ HCV بكفاءة، حتى في التركيزات المنخفضة ولأوقات التعرض القصيرة (24 ساعة )؛ كما أنها تجاوزت القدرات المضادة للفيروسات لـ siRNAs المرجعية التي تستهدف HCV. علاوة على ذلك، فإن HCV353 و HCV258 siRNAs تمنع أيضًا تكرار النمط الجيني لفيروس التهاب الكبد الوبائي 4 المستمد من المريض في خلايا Huh -7 المصابة. لم ينتج عن العلاج المطول لخلايا النسخ المتماثل لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي مع فيروس التهاب الكبد الوبائي سي 353 ظهور فيروسات متحولة للهروب. تكشف هذه النتائج مجتمعة عن دقة وقوة تصميم siRNA المتكامل وبروتوكولات الاختيار. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتصميم تدخلات علاجية قوية للغاية ومحددة قائمة على الحمض النووي الريبي.Translated Description (French)
L'interférence ARN (ARNi) est un mécanisme de silençage génique post-transcriptionnel qui induit la dégradation spécifique à la séquence de l'ARN ciblé et offre ainsi une formidable opportunité pour le développement de médicaments à base d'oligonucléotides. Nous présentons ici un rapport sur la conception et la validation de petits ARN interférents (ARNsi) ciblant des régions hautement conservées du génome du virus de l'hépatite C (VHC). Pour viser des applications thérapeutiques en optimisant l'efficacité de l'ARNi et en réduisant les effets secondaires potentiels, nous avons pris en compte différents facteurs tels que les variations de l'ARN cible, la thermodynamique et l'accessibilité du siRNA et de l'ARN cible, ainsi que les effets hors cible. Cet objectif a été atteint en utilisant un protocole de conception et de sélection in silico complété par un pipeline MysiRNA-Designer automatisé. Le protocole comprenait la conception et la filtration d'ARNsi ciblant des régions hautement conservées et accessibles dans le site d'entrée du ribosome interne du VHC, et des séquences centrales adjacentes du génome viral avec des scores d'efficacité de haut rang. L'analyse hors cible excluait les ARNsi avec une liaison potentielle aux ARNm humains. Dans le cadre de ce processus de sélection strict, deux siRNA (HCV353 et HCV258) ont été sélectionnés en fonction de leur haute spécificité et de leur puissance prédites. Ces ARNsi ont été testés pour leur efficacité antivirale dans les lignées cellulaires réplicon de génotype 1 et 2 du VHC. Les deux siRNA de conception silico ont efficacement inhibé la réplication de l'ARN du VHC, même à de faibles concentrations et pendant de courtes durées d'exposition (24h) ; ils ont également dépassé les pouvoirs antiviraux des siRNA de référence ciblant le VHC. En outre, les ARNsi du VHC353 et du VHC258 ont également inhibé la réplication des isolats de génotype 4 du VHC dérivés du patient dans les cellules Huh-7 infectées. Un traitement prolongé des cellules du réplicon du VHC avec le VHC353 n'a pas entraîné l'apparition de virus mutants d'échappement. Pris ensemble, ces résultats révèlent la précision et la force de nos protocoles intégrés de conception et de sélection d'ARNsi. Ces protocoles pourraient être utilisés pour concevoir des interventions thérapeutiques oligonucléotidiques à base d'ARNi très puissantes et spécifiques.Translated Description (Spanish)
La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional que media la degradación específica de secuencia del ARN dirigido y, por lo tanto, proporciona una gran oportunidad para el desarrollo de fármacos basados en oligonucleótidos. Aquí, informamos sobre el diseño y la validación de ARN interferentes pequeños (ARNip) dirigidos a regiones altamente conservadas del genoma del virus de la hepatitis C (VHC). Para apuntar a aplicaciones terapéuticas optimizando la eficacia del ARNi y reduciendo los posibles efectos secundarios, consideramos diferentes factores como las variaciones del ARN objetivo, la termodinámica y la accesibilidad del ARNip y el ARN objetivo, y los efectos fuera del objetivo. Este objetivo se logró utilizando un protocolo de diseño y selección in silico complementado por un pipeline automatizado MysiRNA-Designer. El protocolo incluyó el diseño y la filtración de ARNip dirigidos a regiones altamente conservadas y accesibles dentro del sitio de entrada del ribosoma interno del VHC, y secuencias centrales adyacentes del genoma viral con puntuaciones de eficacia de alto rango. El análisis fuera de la diana excluyó los ARNip con posible unión a ARNm humanos. Bajo este estricto proceso de selección, se seleccionaron dos ARNip (HCV353 y HCV258) en función de su alta especificidad y potencia predichas. Estos ARNip se probaron para determinar la eficacia antiviral en líneas celulares de replicón de genotipo 1 y 2 del VHC. Ambos ARNip diseñados in silico inhibieron eficazmente la replicación del ARN del VHC, incluso a bajas concentraciones y durante tiempos de exposición cortos (24 h); también excedieron las potencias antivirales de los ARNip de referencia dirigidos al VHC. Además, los ARNip de HCV353 y HCV258 también inhibieron la replicación de aislados de genotipo 4 de HCV derivados del paciente en células Huh-7 infectadas. El tratamiento prolongado de las células del replicón del VHC con HCV353 no dio como resultado la aparición de virus mutantes de escape. En conjunto, estos resultados revelan la precisión y la solidez de nuestros protocolos integrados de diseño y selección de ARNip. Estos protocolos podrían utilizarse para diseñar intervenciones de oligonucleótidos terapéuticos basados en ARNi altamente potentes y específicos.Files
journal.pone.0159211&type=printable.pdf
Files
(4.9 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:fddb0b2833fc0e4b65599851de6a7b5c
|
4.9 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- في التصميم السيليكي والتحقق التجريبي من سيرنا التي تستهدف المناطق المحفوظة من الأنماط الجينية لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي المتعددة
- Translated title (French)
- Conception in silico et validation expérimentale des ARNsi ciblant les régions conservées de génotypes multiples du virus de l'hépatite C
- Translated title (Spanish)
- Diseño in silico y validación experimental de ARNip dirigidos a regiones conservadas de múltiples genotipos del virus de la hepatitis C
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2501892604
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0159211
References
- https://openalex.org/W1483247593
- https://openalex.org/W1516178645
- https://openalex.org/W1520518044
- https://openalex.org/W1542390893
- https://openalex.org/W1592634100
- https://openalex.org/W1647141819
- https://openalex.org/W1966241031
- https://openalex.org/W1966706806
- https://openalex.org/W1966759115
- https://openalex.org/W1969699638
- https://openalex.org/W1970239046
- https://openalex.org/W1971212384
- https://openalex.org/W1974701412
- https://openalex.org/W1977548185
- https://openalex.org/W1977746661
- https://openalex.org/W1977992713
- https://openalex.org/W1985221317
- https://openalex.org/W1986551392
- https://openalex.org/W1986860084
- https://openalex.org/W1988783048
- https://openalex.org/W1991902309
- https://openalex.org/W1996423252
- https://openalex.org/W2003104968
- https://openalex.org/W2003579943
- https://openalex.org/W2003602957
- https://openalex.org/W2010251227
- https://openalex.org/W2019631541
- https://openalex.org/W2019670199
- https://openalex.org/W2020787001
- https://openalex.org/W2021310770
- https://openalex.org/W2022687771
- https://openalex.org/W2029938306
- https://openalex.org/W2030452404
- https://openalex.org/W2030706455
- https://openalex.org/W2033471072
- https://openalex.org/W2038382149
- https://openalex.org/W2042022195
- https://openalex.org/W2043828851
- https://openalex.org/W2055043387
- https://openalex.org/W2060022712
- https://openalex.org/W2065505380
- https://openalex.org/W2068205681
- https://openalex.org/W2072697431
- https://openalex.org/W2073385105
- https://openalex.org/W2076815050
- https://openalex.org/W2077103006
- https://openalex.org/W2085453906
- https://openalex.org/W2087064593
- https://openalex.org/W2092333889
- https://openalex.org/W2095509700
- https://openalex.org/W2097261962
- https://openalex.org/W2097866765
- https://openalex.org/W2106082032
- https://openalex.org/W2106927931
- https://openalex.org/W2107391918
- https://openalex.org/W2107903949
- https://openalex.org/W2107914931
- https://openalex.org/W2108765726
- https://openalex.org/W2110586067
- https://openalex.org/W2110842901
- https://openalex.org/W2111736586
- https://openalex.org/W2119102790
- https://openalex.org/W2124351761
- https://openalex.org/W2128112292
- https://openalex.org/W2128459533
- https://openalex.org/W2129743974
- https://openalex.org/W2130525876
- https://openalex.org/W2131545567
- https://openalex.org/W2133733158
- https://openalex.org/W2137015675
- https://openalex.org/W2137374406
- https://openalex.org/W2140440263
- https://openalex.org/W2140518449
- https://openalex.org/W2141253416
- https://openalex.org/W2143313350
- https://openalex.org/W2145678900
- https://openalex.org/W2149472465
- https://openalex.org/W2149538815
- https://openalex.org/W2150583958
- https://openalex.org/W2151898297
- https://openalex.org/W2157820817
- https://openalex.org/W2160923685
- https://openalex.org/W2162447025
- https://openalex.org/W2164261305
- https://openalex.org/W2165366948
- https://openalex.org/W2166802510
- https://openalex.org/W2169513925
- https://openalex.org/W2328526069
- https://openalex.org/W2417135617
- https://openalex.org/W4210430020
- https://openalex.org/W4230988890
- https://openalex.org/W4376849510