Published December 18, 2023
| Version v1
Publication
Open
Human super antibody to viral RNA-dependent RNA polymerase produced by a modified Sortase self-cleave-bacteria surface display system
Creators
- 1. Siriraj Hospital
- 2. Mahidol University
- 3. Suranaree University of Technology
Description
RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) is a good target of anti-RNA virus agents; not only it is pivotal for the RNA virus replication cycle and highly conserved among RNA viruses across different families, but also lacks human homolog. Recently, human single-chain antibody (HuscFv) that bound to thumb domain of hepatitis C virus (HCV) RNA-dependent RNA polymerase (functionalized NS5B protein) was produced and engineered into cell-penetrating antibody (super antibody) in the form of cell-penetrating peptide (penetratin, PEN)-linked HuscFv (PEN-HuscFv34). The super antibody was produced and purified from inclusion body (IB) of a pen-huscfv34-vector-transformed Escherichia coli. The super antibody inhibited replication of alpha- and beta- coronaviruses, flaviviruses, and picornaviruses that were tested (broadly effective); thus, it has high potential for developing further towards a pan-anti-RNA virus agent. However, production, purification, and refolding of the super antibody molecules from the bacterial IB are laborious and hurdles to large-scale production. Therefore, in this study, Sortase-self-cleave method and bacteria surface display system were combined and modified for the super antibody production.BL21 (DE3) ΔA E. coli, a strain lacking predominant outer membrane protein (OmpA) and ion and OmpT proteases, that displayed a membrane-anchored fusion protein, i.e., chimeric lipoprotein (Lpp')-OmpA', SUMO, Sortase protease, Sortase cleavage site (LPET↓G) and PEN-HuscFv34-6× His was generated. The soluble PEN-HuscFv34-6× His with glycine at the N-terminus could be released from the E. coli surface, simply by incubating the bacterial cells in a Sortase-cleavage buffer. After centrifugation, the G-PEN-HuscFv34-6× His could be purified from the supernatant. The purified G-PEN-HuscFv34-6× retained original cell-penetrating ability (being super antibody) and the broadly effective anti-RNA virus activity of the original IB-derived-PEN-HuscFv34.The functionalized super antibody to RNA virus RdRp was successfully produced by using combined Sortase self-cleave and bacterial surface display systems with modification. The display system is suitable for downstream processing in a large-scale production of the super antibody. It is applicable also for production of other recombinant proteins in soluble free-folding form.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
بوليميراز الحمض النووي الريبوزي المعتمد على الحمض النووي الريبوزي (RdRp) هو هدف جيد لعوامل الفيروسات المضادة للحمض النووي الريبوزي ؛ ليس فقط أنه محوري لدورة تكرار فيروس الحمض النووي الريبوزي ومحافظ عليه بشكل كبير بين فيروسات الحمض النووي الريبوزي عبر العائلات المختلفة، ولكنه يفتقر أيضًا إلى التجانس البشري. في الآونة الأخيرة، تم إنتاج الجسم المضاد البشري أحادي السلسلة (HuscFv) الذي يرتبط بمجال الإبهام من بوليميراز الحمض النووي الريبوزي المعتمد على الحمض النووي الريبي لفيروس التهاب الكبد الوبائي (HCV) (بروتين NS5B الوظيفي) وهندسته في جسم مضاد مخترق للخلايا (جسم مضاد فائق) في شكل ببتيد مخترق للخلايا (penetratin، PEN) مرتبط بـ HuscFv (PEN - HuscFv34). تم إنتاج الجسم المضاد الفائق وتنقيته من جسم التضمين (IB) من الإشريكية القولونية التي تحولت إلى ناقلات القلم huscfv34. قام الجسم المضاد الفائق بتثبيط تكاثر فيروسات ألفا وبيتا كورونا وفيروسات الفلافين وفيروسات بيكورنا التي تم اختبارها (فعالة على نطاق واسع )؛ وبالتالي، فإن لديها إمكانات عالية لمزيد من التطور نحو عامل فيروس مضاد للحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فإن إنتاج وتنقية وإعادة طي جزيئات الأجسام المضادة الفائقة من IB البكتيرية شاقة وعقبات أمام الإنتاج على نطاق واسع. لذلك، في هذه الدراسة، تم الجمع بين طريقة الفرز الذاتي ونظام عرض سطح البكتيريا وتعديلهما لإنتاج الأجسام المضادة الفائقة. BL21 (DE3) ΔA E. coli، وهي سلالة تفتقر إلى بروتين الغشاء الخارجي السائد (OmpA) وبروتينات الأيون و OmpT، التي عرضت بروتينًا اندماجيًا مثبتًا بالغشاء، أي البروتين الدهني الخيمري (Lpp') - OmpA 'والسومو وبروتياز الفرز وموقع انقسام الفرز (LPET↓ G) و PEN - HuscFv34 -6 × تم توليده. يمكن إطلاق PEN - HuscFv34 -6 × His القابل للذوبان مع الجلايسين عند الطرف N من سطح الإشريكية القولونية، ببساطة عن طريق حضانة الخلايا البكتيرية في منطقة عازلة لانشقاق الفرز. بعد الطرد المركزي، يمكن تنقية G - PEN - HuscFv34 -6 × His من المادة الطافية. احتفظ G - PEN - HuscFv34 -6 × المنقى بالقدرة الأصلية على اختراق الخلايا (كونه جسمًا مضادًا فائقًا) والنشاط الفعال على نطاق واسع للفيروس المضاد للحمض النووي الريبي لـ IB - PEN - HuscFv34 الأصلي. تم إنتاج الجسم المضاد الفائق الوظيفي لفيروس الحمض النووي الريبي RdRp بنجاح باستخدام أنظمة العرض السطحية ذاتية الالتصاق والبكتيرية مع التعديل. نظام العرض مناسب للمعالجة النهائية في إنتاج واسع النطاق للجسم المضاد الفائق. وهو قابل للتطبيق أيضًا لإنتاج البروتينات المؤتلفة الأخرى في شكل قابل للطي الحر قابل للذوبان.Translated Description (French)
L'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) est une bonne cible des agents anti-virus ARN ; non seulement elle est essentielle pour le cycle de réplication du virus ARN et hautement conservée parmi les virus ARN de différentes familles, mais elle manque également d'homologue humain. Récemment, un anticorps monocaténaire humain (HuscFv) lié au domaine du pouce de l'ARN polymérase ARN-dépendante du virus de l'hépatite C (VHC) (protéine NS5B fonctionnalisée) a été produit et transformé en anticorps pénétrant les cellules (super anticorps) sous la forme d'HuscFv lié à un peptide pénétrant les cellules (pénétratine, STYLO) (PEN-HuscFv34). Le super anticorps a été produit et purifié à partir du corps d'inclusion (IB) d'un Escherichia coli transformé par un vecteur Pen-huscfv34. Le super anticorps a inhibé la réplication des coronavirus alpha et bêta, des flavivirus et des picornavirus qui ont été testés (largement efficaces) ; ainsi, il a un fort potentiel de développement ultérieur vers un agent de virus pan-anti-ARN. Cependant, la production, la purification et le repliement des molécules de superanticorps à partir de l'IB bactérien sont laborieux et constituent des obstacles à la production à grande échelle. Par conséquent, dans cette étude, la méthode d'auto-clivage de la triase et le système d'affichage de la surface des bactéries ont été combinés et modifiés pour la production de superanticorps.BL21 (de3) ΔA E. coli, une souche dépourvue de protéine prédominante de la membrane externe (OmpA) et de protéases ioniques et OmpT, qui présentait une protéine de fusion ancrée dans la membrane, c'est-à-dire, la lipoprotéine chimérique (Lpp') -OmpA', SUMO, protéase de la triase, site de clivage de la triase (LPET↓G) et PEN-HuscFv34-6 × His a été générée. Le PEN-HuscFv34-6 × His soluble avec de la glycine à l'extrémité N-terminale pourrait être libéré de la surface d'E. coli, simplement en incubant les cellules bactériennes dans un tampon de clivage Sortase. Après centrifugation, le G-PEN-HuscFv34-6× His a pu être purifié du surnageant. Le G-PEN-HuscFv34-6 × purifié a conservé la capacité originale de pénétration cellulaire (étant un super anticorps) et l'activité antivirale anti-ARN largement efficace du PEN-HuscFv34 original dérivé de l'IB. Le super anticorps fonctionnalisé contre le virus à ARN RdRp a été produit avec succès en utilisant des systèmes combinés d'auto-clivage de Sortase et d'affichage de surface bactérienne avec modification. Le système d'affichage est approprié pour un traitement en aval dans une production à grande échelle du super anticorps. Il est également applicable à la production d'autres protéines recombinantes sous forme soluble se repliant librement.Translated Description (Spanish)
La ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) es una buena diana de los agentes virales anti-ARN; no solo es fundamental para el ciclo de replicación del virus de ARN y está altamente conservada entre los virus de ARN de diferentes familias, sino que también carece de homólogo humano. Recientemente, se produjo un anticuerpo monocatenario humano (HuscFv) que se unía al dominio del pulgar de la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus de la hepatitis C (VHC) (proteína NS5B funcionalizada) y se modificó en un anticuerpo de penetración celular (superanticuerpo) en forma de péptido de penetración celular (penetratina, PEN)unido a HuscFv (PEN-HuscFv34). El superanticuerpo se produjo y purificó a partir del cuerpo de inclusión (IB) de una Escherichia coli transformada con el vector pen-huscfv34. El superanticuerpo inhibió la replicación de los coronavirus alfa y beta, flavivirus y picornavirus que se probaron (ampliamente efectivo); por lo tanto, tiene un alto potencial para desarrollarse aún más hacia un agente de virus pan-anti-ARN. Sin embargo, la producción, purificación y replegamiento de las moléculas de superanticuerpos del IB bacteriano son laboriosas y obstaculizan la producción a gran escala. Por lo tanto, en este estudio, se combinaron y modificaron el método de autoescisión de sortasa y el sistema de presentación en superficie de bacterias para la producción de superanticuerpos. Se generó SUMO, sortasa proteasa, sitio de escisión de sortasa (LPET↓ G) y PEN-HuscFv34-6× His. El PEN-HuscFv34-6 × His soluble con glicina en el extremo N podría liberarse de la superficie de E. coli, simplemente incubando las células bacterianas en un amortiguador de escisión de sortasa. Después de la centrifugación, el G-PEN-HuscFv34-6 × His podría purificarse del sobrenadante. El G-PEN-HuscFv34-6x purificado retuvo la capacidad de penetración celular original (siendo superanticuerpo) y la actividad anti-virus de ARN ampliamente eficaz del PEN-HuscFv34 derivado de IB original. El superanticuerpo funcionalizado contra el virus de ARN RdRp se produjo con éxito mediante el uso de sistemas combinados de autoescisión de Sortase y de presentación en superficie bacteriana con modificación. El sistema de visualización es adecuado para el procesamiento posterior en una producción a gran escala del superanticuerpo. También es aplicable para la producción de otras proteínas recombinantes en forma soluble de plegamiento libre.Files
s12934-023-02267-z.pdf
Files
(3.1 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:2bc007a76fcaac547dadf18203ced745
|
3.1 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- جسم مضاد بشري فائق لبوليميراز الحمض النووي الريبوزي الفيروسي المعتمد على الحمض النووي الريبوزي الذي ينتجه نظام عرض سطح البكتيريا ذات الشق الذاتي المعدل من نوع Sortase
- Translated title (French)
- Super-anticorps humain contre l'ARN polymérase virale ARN-dépendante produite par un système d'affichage de surface Sortase modifié auto-clivé-bactéries
- Translated title (Spanish)
- Superanticuerpo humano contra la ARN polimerasa dependiente de ARN viral producida por un sistema de presentación superficial de bacterias autoescindibles Sortase modificado
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W4389925549
- DOI
- 10.1186/s12934-023-02267-z
References
- https://openalex.org/W1517600110
- https://openalex.org/W1563454002
- https://openalex.org/W1964438144
- https://openalex.org/W1966070420
- https://openalex.org/W2007527881
- https://openalex.org/W2012581607
- https://openalex.org/W2019462587
- https://openalex.org/W2026057748
- https://openalex.org/W2058907741
- https://openalex.org/W2062667221
- https://openalex.org/W2069151297
- https://openalex.org/W2070709658
- https://openalex.org/W2073344935
- https://openalex.org/W2079512206
- https://openalex.org/W2085323444
- https://openalex.org/W2122500226
- https://openalex.org/W2130001012
- https://openalex.org/W2132502750
- https://openalex.org/W2145605402
- https://openalex.org/W2146313224
- https://openalex.org/W2257974587
- https://openalex.org/W2290382464
- https://openalex.org/W2418881360
- https://openalex.org/W2592945002
- https://openalex.org/W2611885593
- https://openalex.org/W2750888071
- https://openalex.org/W2786695043
- https://openalex.org/W2796061259
- https://openalex.org/W2810623735
- https://openalex.org/W2903899730
- https://openalex.org/W2929124316
- https://openalex.org/W2952116753
- https://openalex.org/W2965844971
- https://openalex.org/W2999958881
- https://openalex.org/W3001897055
- https://openalex.org/W3033802766
- https://openalex.org/W3108130218
- https://openalex.org/W4206210292
- https://openalex.org/W4206712614
- https://openalex.org/W4282585112
- https://openalex.org/W4286669167
- https://openalex.org/W4296918540
- https://openalex.org/W4316664764
- https://openalex.org/W4323067254
- https://openalex.org/W4366085893
- https://openalex.org/W4367366390
- https://openalex.org/W4383897073