Published November 1, 2002 | Version v1
Publication Open

The Modulation of Mitochondrial Nitric-oxide Synthase Activity in Rat Brain Development

Creators

  • 1. University of Buenos Aires
  • 2. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
  • 3. University of Southern California

Description

Different mitochondrial nitric-oxide synthase (mtNOS) isoforms have been described in rat and mouse tissues, such as liver, thymus, skeletal muscle, and more recently, heart and brain. The modulation of these variants by thyroid status, hypoxia, or gene deficiency opens a broad spectrum of mtNOS-dependent tissue-specific functions. In this study, a new NOS variant is described in rat brain with an M r of 144 kDa and mainly localized in the inner mitochondrial membrane. During rat brain maturation, the expression and activity of mtNOS were maximal at the late embryonic stages and early postnatal days followed by a decreased expression in the adult stage (100 ± 9versus 19 ± 2 pmol of [3H]citrulline/min/mg of protein, respectively). This temporal pattern was opposite to that of the cytosolic 157-kDa nNOS protein. Mitochondrial redox changes followed the variations in mtNOS activity: mtNOS-dependent production of hydrogen peroxide was maximal in newborns and decreased markedly in the adult stage, thus reflecting the production and utilization of mitochondrial matrix nitric oxide. Moreover, the activity of brain Mn-superoxide dismutase followed a developmental pattern similar to that of mtNOS. Cerebellar granular cells isolated from newborn rats and with high mtNOS activity exhibited maximal proliferation rates, which were decreased by modifying the levels of either hydrogen peroxide or nitric oxide. Altogether, these findings support the notion that a coordinated modulation of mtNOS and Mn-superoxide dismutase contributes to establish the rat brain redox status and participate in the normal physiology of brain development. Different mitochondrial nitric-oxide synthase (mtNOS) isoforms have been described in rat and mouse tissues, such as liver, thymus, skeletal muscle, and more recently, heart and brain. The modulation of these variants by thyroid status, hypoxia, or gene deficiency opens a broad spectrum of mtNOS-dependent tissue-specific functions. In this study, a new NOS variant is described in rat brain with an M r of 144 kDa and mainly localized in the inner mitochondrial membrane. During rat brain maturation, the expression and activity of mtNOS were maximal at the late embryonic stages and early postnatal days followed by a decreased expression in the adult stage (100 ± 9versus 19 ± 2 pmol of [3H]citrulline/min/mg of protein, respectively). This temporal pattern was opposite to that of the cytosolic 157-kDa nNOS protein. Mitochondrial redox changes followed the variations in mtNOS activity: mtNOS-dependent production of hydrogen peroxide was maximal in newborns and decreased markedly in the adult stage, thus reflecting the production and utilization of mitochondrial matrix nitric oxide. Moreover, the activity of brain Mn-superoxide dismutase followed a developmental pattern similar to that of mtNOS. Cerebellar granular cells isolated from newborn rats and with high mtNOS activity exhibited maximal proliferation rates, which were decreased by modifying the levels of either hydrogen peroxide or nitric oxide. Altogether, these findings support the notion that a coordinated modulation of mtNOS and Mn-superoxide dismutase contributes to establish the rat brain redox status and participate in the normal physiology of brain development. nitric-oxide synthase nitric oxide endothelial nitric-oxide synthase inducible nitric-oxide synthase mitochondrial nitric-oxide synthase neuronal nitric-oxide synthase peroxynitrite (3-[(3-cholamidopropyl) dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate) NG-monomethyl-l-arginine tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin phosphate-buffered saline embryonic postnatal In recent years, the occurrence of nitric-oxide synthase (NOS)1 variants located in mitochondria (mtNOS) has been reported: an iNOS protein was detected in rat liver and thymus and pig heart (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 2Bustamante J. Bersier G. Badin R.A. Cymering C. Parodi A. Boveris A. Nitric Oxide. 2002; 6: 333-341Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 3French S. Giulivi C. Balaban R.S. Am. J. Physiol. 2001; 280: H2863-H2867PubMed Google Scholar), eNOS was found in rat skeletal muscle and liver (4Stamler J.S. Meissner G. Physiol. Rev. 2001; 81: 209-237Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar, 5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 1609-1615Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar), and nNOS was described in rat skeletal muscle (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282-H2288PubMed Google Scholar) and mouse heart (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 14126-14131Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). Thus, the mtNOS family appears to cover a broad spectrum of structurally and immunologically different proteins that could result from transcriptional or translational modifications that allow them to be targeted to mitochondria. However, differences between mtNOS and the classic NOS isoforms were reported: liver mtNOS exhibits an amino acid sequence similar to iNOS (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 9Lopez M.F. Kristal B.S. Chernokalskaya E. Lazarev A. Shestopalov A.I. Bogdanova A. Robinson M. Electrophoresis. 2000; 21: 3427-3440Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar), albeit with a distinctive acylation pattern (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar); mtNOS activity invariably depends on Ca2+ and calmodulin, even when it may be immunologically related to iNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282-H2288PubMed Google Scholar); and a distinct kinetic pattern has been observed for mtNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). mtNOS seems to possess functions adapted to tissue-specific needs. In support of this notion, mtNOS activities in liver and skeletal muscle are modulated by the thyroid status (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282-H2288PubMed Google Scholar), and those in brain and liver are modulated by hypoxia (5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 1609-1615Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). Moreover, the level of mtNOS expression is modified by the activity or deficiency of specific genes, such as dystrophin in the heart (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 14126-14131Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). The regulation of mtNOS provides a new insight into the physiological significance of ⋅NO and mitochondria in cell biology. It is well known that ⋅NO binds to cytochrome oxidase with high affinity, modulates O2 uptake (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 11Brown G.C. Copper C.E. FEBS Lett. 1994; 356: 295-298Crossref PubMed Scopus (952) Google Scholar), and increases the mitochondrial production of superoxide anion (O 2⨪), and depending on mitochondrial matrix Mn-superoxide dismutase levels, of hydrogen peroxide (H2O2) (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). Accordingly, activation of mtNOS could be followed by an increase in the rate of mitochondrial H2O2 production rate (13Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6945-6949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar). H2O2, generated in this manner, is involved in the regulation of different cellular processes: in brain, it could participate in cell signaling networks during early synaptogenesis and plasticity (14Yermolaieva O. Brot N. Weissbach H. Heinemann S.H. Hoshi T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 448-453Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar); furthermore, following mtNOS activation, an exacerbated oxidant production may play a role in apoptotic signaling (15Ghafourifar P. Bringold U. Klein S.D. Richter C. Biol. Signals Recept. 2001; 10: 57-65Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar). Characteristically, nNOS and splice variants of thenNOS gene with distinctive subcellular localizations are differentially expressed during the embryonic life (16Eliasson M. Blackshaw S. Schell M.J. Snyder S.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 3396-3401Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) and are related to the normal development of the brain (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). These studies were aimed at analyzing the occurrence of an NOS activity localized in brain mitochondria, its developmental profile, and its influence on redox metabolism. The physiological significance of these studies was strengthened by an experimental approach aimed at providing a relationship between mitochondrial production of ⋅NO and H2O2 and neuron proliferation. 3-Amino-1,2,4-triazole, aprotinin, l-arginine, bovine serum albumin, calmodulin, catalase, CHAPS, Cu,Zn superoxide dismutase, cytochrome c, dithiothreitol, EDTA, FAD, FMN, glutathione, HEPES, horseradish peroxidase, hydrogen peroxide, KCN, leupeptin, NADPH,N G-monomethyl-l-arginine (l-NMMA), ovomucoid, Percoll, phenylmethylsulfonyl fluoride, p-hydroxy-phenyl acetic acid, poly-d-lysine, sucrose, tetrahydrobiopterin, Tris, trypsin, xanthine, and xanthine oxidase were from Sigma. Mn(III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride (Mn(III) TBAP) was from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI), and DNase was from Roche Molecular Biochemicals. N-Acetyl cysteine was a gift from Dr. Daniel Colombari (Poen Laboratories, Buenos Aires, Argentina). Monoclonal antibodies anti-neuronal NOS (1095–1289), polyclonal anti-endothelial NOS, and polyclonal anti-macrophage iNOS were from Transduction Laboratories (Lexington, KY); polyclonal anti-neuronal NOS (1409–1429) and monoclonal anti-neuronal NOS (1–181) were from Sigma. l-[2,3,-3H]Arginine was from PerkinElmer Life Sciences. Acrylamide solutions, polyvinylidene difluoride membranes, anti-mouse and anti-rabbit IgG antibodies, and Immun-Star® kit were from Bio-Rad. Nitric oxide solutions (1.2–1.8 mm) were obtained by bubbling⋅NO gas to 99.9% purity (AGA Gas Inc., Maumee, OH) in water degassed with helium for 30 min at room temperature and stocked for a week at 4 °C. Adult Wistar rats were sacrificed by decapitation, and the brain or cerebellum was rapidly removed and homogenized in 320 mm sucrose/20 mm HEPES, pH 7.2, containing 1 mm EDTA, 1 mm dithiothreitol, 10 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml aprotinin, and 10 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride. For developmental experiments, brain or cerebellum dissected from embryos (n = 15–30) or neonate animals of different ages (n = 5–10) was pooled. Mitochondria and synaptosomes were purified by Percoll gradient centrifugation as described (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar) in a buffer consisting of 0.23m mannitol, 0.07 m sucrose, 0.5 mmEGTA, and 2 mm HEPES, pH 7.4. The cytosolic fraction was obtained after 100,000 × g centrifugation of the 8,000 × g supernatant of brain homogenates. Except for experiments in the presence of proteinase K, which required intact mitochondria, and the isolation of submitochondrial particles, all determinations were performed utilizing once frozen/thawed mitochondria. Percoll-purified mitochondria were frozen and thawed three times and then sonicated twice at 40 watts with a Cole-Parmer sonicator (WPI, Sarasota, FL). Subsequently, samples were centrifuged for 10 min at 8,000 ×g to precipitate unbroken mitochondria, and the supernatant was then centrifuged for 30 min at 100,000 × g. The supernatant (soluble fraction) was separated from the pellet (membranes), and the latter was suspended in 0.25 msucrose, 10 mm HEPES, pH 7.4, containing 2 mm dithiothreitol and 20 mm CHAPS and incubated for 20 min at 4 °C under gentle shaking. The preparation was then centrifuged for 30 min at 100,000 × g, and the supernatant (CHAPS-soluble fraction) and pellet (CHAPS-insoluble fraction) were separated and stored at −70 °C until used. ⋅NO production was assessed by the conversion of [3H]l-arginine to [3H] l-citrulline as described previously (18Knowles R. Salter M. Titheradge M. Nitric Oxide Protocols. Human Press, Totowa, NJ1998: 67-73Google Scholar) with minor modifications. Mitochondrial and cytosolic activities were measured in 50 mm potassium phosphate, pH 7.2, in the presence of either 120 μm (mitochondria) or 20 μm (cytosol) l-arginine, 100 μmNADPH, 0.1 μm calmodulin, 0.3 mmCaCl2, 1 μm FAD, 1 μm FMN, 10 μm tetrahydrobiopterin, and 100 μg of mitochondrial protein. Specific activity was calculated by subtracting the remaining activity in the presence of 10-fold excess concentration of the nitric oxide synthase inhibitor NMMA. Purified mitochondria were suspended in 4% formaldehyde freshly prepared from paraformaldehyde in PBS, pH 7.4, for 2 h at 4 °C and then dehydrated in 70, 96, and 100% ethanol (30 min for each step) and embedded in LR White. Slides were obtained with glass knives and placed on nickel grids over Formvar membranes. Immunocytochemistry was performed using a primary rabbit anti C-terminal nNOS (1409–1429) at a dilution of 1:100 in PBS, pH 7.4. After washing with PBS, a goat anti-rabbit serum conjugated with colloidal gold (10-nm diameter particles) was used at a dilution of 1:100 in PBS, pH 7.4. Grids were washed again in PBS and slightly counterstained with 1% uranyl acetate in water for 5 min. Nonspecific background was blocked by incubating the grids with 5% normal goat serum in PBS at the beginning of the procedure. Specimens were observed in a Zeiss EM-109-T transmission electron microscope at 80 kV. H2O2production was continuously monitored in a Hitachi F-2000 spectrofluorometer (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) with excitation and emission wavelengths at 315 and 425 nm, respectively (19White R.J. Reynolds I.J. J. Neurosci. 1996; 16: 5688-5697Crossref PubMed Google Scholar). The assay medium consisted of 25 mm sucrose, 5 mmMgCl2, 20 mm KCl, 10 mmPO4K2, and 20 mm HEPES, pH 7.4, and it was supplemented with 12.5 units/ml horseradish peroxidase, 50 μm p-hydroxyphenylacetic acid, and 0.1 mg of mitochondrial protein/ml with 6 mm succinate as substrate. To explore the effects of ⋅NO and mtNOS activity on mitochondrial H2O2 production rate, the assay was initiated by supplementation with either 0.1 mml-arginine or a pulse of ⋅NO or 2 μmantimycin A. To assess specific mtNOS-dependent H2O2 production rates, 1 mml-NMMA was added to the mitochondrial preparations in the appropriate cases. To restrict oxidative decay of intramitochondrial⋅NO, assays were carried out at about 70 μmO2. All fluorometric variations in the different conditions were attributable to H2O2 as they were completely inhibited by supplementation with 3 μmcatalase. To make the maximal H2O2 production rate uniform, mitochondrial preparations were supplemented with 1 mm of the superoxide dismutase mimetic Mn(III) TBAP. NADH-cytochrome c reductase and succinate-cytochrome c reductase activities (complexes I–III and complexes II and III, respectively) were assayed spectrophotometrically by determining cytochrome c reduction at 550 nm in the presence of 30 μm cytochromec, 1 mm KCN, and either 150 μmNADH or 8 mm succinate as electron donors. Cytochrome oxidase activity (complex IV) was determined by recording the oxidation of 50 μm reduced cytochrome c in a Hitachi 3000 spectrophotometer at 550 nm; ε550 = 21 mm−1 cm−1 (20Wharton D.C. Tzagoloff A. Methods Enzymol. 1967; 10: 245-250Crossref Scopus (1331) Google Scholar). The rate of the reaction was determined as the pseudo-first order reaction (k′) constant and expressed as min−1 mg of protein−1. Ubiquinone content in isolated mitochondria was determined by high pressure liquid chromatography (Waters) with UV detection at 275 nm after extraction with cyclohexane:ethano1 (5:2) (6 mg of mitochondrial protein/ml and 7 ml of cyclohexane:ethanol) (21Lang J.K. Gohil K. Packer L. Anal. Biochem. 1986; 157: 106-116Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar). Mn- and Cu,Zn-superoxide dismutase activities were determined spectrophotometrically by measuring the inhibition of cytochromec reduction by the xanthine/xanthine oxidase system, as described previously (22McCord J.M. Fridovich I. J. Biol. Chem. 1969; 244: 6049-6055Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Briefly, the reduction rate of 10 μm cytochrome c by 3.5 microunits/ml xanthine oxidase and 50 μm xanthine was followed in the absence (basal) or presence of 100 μg of cytosolic or mitochondrial proteins. Both cytochrome oxidase and Cu,Zn-superoxide dismutase were inhibited by 1 mm KCN. Superoxide dismutase units in each fraction were calculated by extrapolation from a calibration curve with titrated commercial Cu,Zn-superoxide dismutase. Aliquots of 100 μg of protein were separated by electrophoresis on reducing 6% SDS-polyacrylamide gels and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Membranes were washed with 0.1% Tween 20 in 20 mm Tris-buffered saline solution, pH 7.4, and blocked with 4% non-fat milk. Membranes were incubated with the first antibody (1 h, 1:1000 dilution), washed, and subsequently incubated with a secondary goat anti-mouse or anti-rabbit IgG antibody conjugated to alkaline phosphatase (1 h, 1:3000 dilution). Bands were detected by chemiluminescence using Immun-Star® (Bio-Rad). Quantification of bands was performed by digital image analysis using a Hewlett-Packard scanner and Totallab analyzer software (Nonlinear Dynamics, Biodynamics). Cerebellar granule cell cultures were obtained as described previously (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998; 107: 43-48Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Five-day-old Sprague-Dawley rats were decapitated, and cerebella were dissected in Krebs-Ringer solution supplemented with 6 g/l glucose. Meninges were eliminated, and tissue was cut into 1-mm pieces and incubated in saline containing 0.025% trypsin, 1.2 mm MgSO4, and 3 mg/ml bovine serum albumin for 15 min at 37 °C with continuous agitation. The enzymatic digestion was stopped with ovomucoid (trypsin inhibitor), and the tissue was mechanically dissociated with Pasteur pipettes of two different diameters (25 strokes) in saline-containing ovomucoid and 0.01% DNase. The cell suspension was centrifuged at 150 ×g for 10 min, and the pellet was resuspended in cell culture medium (Neurobasal, Invitrogen). Cells were inoculated onto 96 multiwells (300,000 cells/well) coated with poly-d-lysine (molecular weight 300,000) in serum-free medium supplemented with B27 (Invitrogen). Cells were seeded on 96 multiwells, and after 2 h, they were incubated with [3H]thymidine (1 mCi/ml) for 22 h. Drug treatments were performed simultaneously with the addition of [3H]thymidine. The cells were osmotically disrupted through a 2-min incubation with bidistilled water and harvested with a Nunc cell harvester coupled to glass fiber filters (Whatman, GF/C) as described previously (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998; 107: 43-48Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Filters were washed seven times with bidistilled water and allowed to dry overnight. Radioactivity was counted in a liquid scintillation β-counter. [3H]Thymidine incorporation was expressed as the ratio (experimental − control)/control. Student's t test and linear regression analysis were used as appropriate; statistical significance was accepted at p < 0.05. NOS activity was assessed in rat brain cytosol, synaptosomes, and purified mitochondria (TableI). In samples obtained from adult rats, the activity present in the mitochondrial fraction represented about 10% of that of cytosolic nNOS. The purification of mitochondria from organelles with similar sedimentation properties was confirmed by measuring the ratio between succinate-cytochrome c reductase (mitochondrial marker) and acidic phosphatase (lysosomal marker) activities. The mitochondrial preparations used throughout this study were enriched about 30-fold in mitochondrial markers. In addition, we confirmed the purity and the integrity of mitochondria by electron microscopy.Table IDistribution of nitric oxide synthase activity in brain tissueFractionSpecific Activitypmol 3H-citrulline/min/mg of proteinSubcellular levelCytosol180 ± 16Synaptosomes54 ± 4Mitochondria17 ± 1Submitochondrial levelSoluble2 ± 0.1Membranes60 ± 4CHAPS-soluble fraction43 ± 4CHAPS-insoluble fraction252 ± 19The different fractions were obtained as described under "Materials and Methods." Data are the means of three different experiments (expressed as mean ± S.E.). Open table in a new tab The different fractions were obtained as described under "Materials and Methods." Data are the means of three different experiments (expressed as mean ± S.E.). NOS activity was not affected by pretreatment of intact mitochondria with proteinase K, suggesting that it was not a product of cytosolic contamination and that the protein was localized inside the organelles. Accordingly, after fractionation of submitochondrial particles, NOS activity was enriched by 18-fold in the membrane fraction, which was mainly composed of inner mitochondrial membrane (CHAPS-insoluble fraction) (Table I). Brain mtNOS activity was dependent on tetrahydrobiopterin, Ca2+/calmodulin, and NADPH, and to a lesser extent, on flavins (Fig. 1), as reported previously for nNOS. The mitochondrial NOS activity that represented theN G-monomethyl-l-arginine-sensitive activity was also inhibited by the NOS inhibitorsNG-nitro-l-arginine, 7-nitroindazol, andN-iminoethyl-l-ornithine and by the flavoprotein inhibitor, diphenylene iodonium. Preliminary kinetics studies yielded a similar apparent K m for mtNOS and nNOS (2–12 μm). Cytosolic nNOS (157 kDa) was not observed in mitochondria; instead, a band ofM r ≈ 144 kDa was detected by two anti-nNOS antibodies directed to the C-terminal domain (anti-nNOS 1409–1429 and anti-nNOS 1095–1289) but not by antibodies directed to theN-terminal segment (anti-nNOS 1–181) (Fig.2 A). In addition, the 144-kDa protein did not cross-react with anti-eNOS or anti-iNOS antibodies (Fig. 2 A). The antibody against the NADPH-binding site of nNOS (anti-nNOS 1095–1289) abolished NOS activity in mitochondria, whereas neither anti-nNOS 1409–1429 nor anti-nNOS 1–181 did, thus confirming the identity of the band (Fig. 2 B). The synaptosomal fraction, nerve end terminals containing synaptic mitochondria, exhibited a double band of nNOS (157 kDa) and mtNOS (144 kDa) proteins (Fig. 2 C). The specific detection of mtNOS by anti-nNOS 1409–1429 was used to assess by means of immuno-electron microscopy the localization of mtNOS at the ultrastructural level. In these conditions, colloidal gold particles were clearly detected in mitochondria (Fig. 3 A). Moreover, the background levels were low, and samples processed with normal rabbit serum as a primary antibody did not show any labeling, thus confirming the specificity of the reaction. A more detailed study of the ultrastructural localization of the enzyme in mitochondria using a higher dilution of the first serum showed that labeling was mainly located in the inner face of the mitochondrial inner membrane, and to a lesser extent, in the mitochondrial matrix. (Fig. 3 B). The up-regulation of a 144-kDa nNOS variant in rat synaptosomes was reported to occur early after birth (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). In this study, the expression (Fig. 4) and activity (Fig. 5) of mtNOS in the brain of embryos and neonate animals in parallel to cytosolic nNOS were addressed as follows. (a) Cytosolic nNOS activity and expression were faintly detectable by embryonic day 15 and 19 and increased after birth to peak around the second and third postnatal weeks (Fig. 4 A) (as reported previously (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar)). (b) mtNOS activity showed a different developmental pattern: its expression and activity were elevated throughout the late embryonic period (Fig. 4 B; E15–E19) up to the first postnatal week (Fig. 4 B; P0–P6) and markedly decreased beyond this age. Thus, at P0, mtNOS protein expression and activity were about 6-fold higher than the corresponding adult values. The modulation of mtNOS activity was attributed to changes in protein expression, as inferred from the respective ratios (Fig. 5). Furthermore, mtNOS followed a similar developmental pattern in cerebellum, although elevated activity persisted until postnatal day 15 (Fig. 5, inset). (c) Studies on the synaptosomal fraction permitted us to observe the co-modulation of both mtNOS and nNOS: in this preparation, mtNOS from synaptic mitochondria was apparently unique during the first 4 days; beyond this time point, both enzymes could be detected (Fig.4 C).Figure 5Nitric-oxide synthase-specific activities during rat brain development. The nitric-oxide synthase-specific activities during development were measured in the brain cytosolic and mitochondrial fractions described in the legend for Fig. 4 and according to "Materials and Methods." Inset, mitochondrial nitric-oxide synthase activity during postnatal maturation of rat cerebellum. The arrows indicate the moment of birth.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) In different rat tissues, ⋅NO induces an increase of mitochondrial O 2⨪ and H2O2 production rates by mechanisms involving inhibition of electron transfer at thebc 1 segment (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar) and oxidation of membrane-bound ubiquinol (Reaction 1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar, 13Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6945-6949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar, 24Riobó N.A. Clementi E. Melani M. Boveris A. Cadenas E. Moncada S. Poderoso J.J. Biochem. J. 2001; 359: 139-145Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) followed by ubisemiquinone autoxidation (Reaction 2). UQH−+⋅NO→UQ⋅−+NO− REACTION1 UQ2⨪+O2→UQ+O2⨪ REACTION2The production of H2O2 by both P2–4 neonatal and adult brain mitochondria showed a biphasic response to⋅NO (Fig. 6). The ascending and descending slopes of the curves are determined by the relative ratio of the two competing reactions (Reactions 3 and 4) that drive mitochondrial matrix O 2⨪ to either H2O2(catalyzed by Mn-superoxide dismutase; Reaction 3;k 3 = 2 × 109m−1 s−1) or ONOO−(by reacting with ⋅NO; Reaction 4; k 4 = 1.9 × 1010m−1s−1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). O2⨪+O2⨪+2H+→H2O2+O2 REACTION3 O2⨪+⋅NO→ONOO− REACTION4Comparable maximal H2O2 production rates (0.4–0.5 nmol/min/mg of protein) were achieved at 0.1 μm⋅NO in adults and at 0.2 μm⋅NO in neonates (Fig. 6). In addition, total ubiquinone was ∼20% lower in mitochondria from neonates than in those from adults. The ubiquinone-reducing activities of complexes I–III and complexes II–III as well as the activity of complex IV were ∼45–50% lower in neonates than those in adult animals (TableII). These data may explain the 2-fold higher ⋅NO concentration required in neonatal mitochondria to elicit an H2O2 production rate similar to that in adult mitochondria.Table IIMitochondrial complex activities and ubiquinone content in brain from newborn and adult ratsI–IIIII–IIIIV[UQ9]nmoles cyt c/min/mg of proteink′ min/mg of proteinμg/mg of proteinNewborn185 ± 2142 ± 99 ± 2408 ± 1Adult337 ± 2081 ± 1718 ± 5522 ± 3Complexes I–III, NADH-cytochrome c reductase, complexes II–III, succinate-cytochrome c reductase; complex IV, cytochrome oxidase. UQ9, ubiquinone. Data are expressed as mean ± S.E. from five to ten different experiments. Open table in a new tab Complexes I–III, NADH-cytochrome c reductase, complexes II–III, succinate-cytochrome c reductase; complex IV, cytochrome oxidase. UQ9,

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

تم وصف أشكال مختلفة من سينثاز أكسيد النيتريك للميتوكوندريا (mtNOS) في أنسجة الفئران والفئران، مثل الكبد والغدة الصعترية والعضلات الهيكلية، ومؤخراً القلب والدماغ. يؤدي تعديل هذه المتغيرات حسب حالة الغدة الدرقية أو نقص الأكسجة أو نقص الجينات إلى فتح مجموعة واسعة من الوظائف الخاصة بالأنسجة المعتمدة على mtNOS. في هذه الدراسة، تم وصف متغير NOS جديد في دماغ الفئران مع Mr من 144 kDa وموضع بشكل رئيسي في الغشاء الميتوكوندريا الداخلي. أثناء نضج دماغ الفئران، كان تعبير ونشاط mtNOS أقصى في المراحل الجنينية المتأخرة وأيام ما بعد الولادة المبكرة متبوعًا بانخفاض التعبير في مرحلة البلوغ (100 ± 9 مقابل 19 ± 2 pmol من [3H]سيترولين/دقيقة/ملغ من البروتين، على التوالي). كان هذا النمط الزمني معاكسًا لنمط البروتين الخلوي 157 - kDa nNOS. تبعت تغيرات اختزال الميتوكوندريا الاختلافات في نشاط mtNOS: كان الإنتاج المعتمد على mtNOS لبيروكسيد الهيدروجين أقصى ما يمكن في الأطفال حديثي الولادة وانخفض بشكل ملحوظ في مرحلة البلوغ، مما يعكس إنتاج واستخدام أكسيد النيتريك المصفوفة الميتوكوندريا. علاوة على ذلك، اتبع نشاط ديسموتاز المنجنيز الفائق في الدماغ نمطًا تنمويًا مشابهًا لنمط mtNOS. أظهرت الخلايا الحبيبية المخيخية المعزولة عن الفئران حديثي الولادة وذات النشاط العالي mtNOS معدلات انتشار قصوى، والتي انخفضت عن طريق تعديل مستويات إما بيروكسيد الهيدروجين أو أكسيد النيتريك. إجمالاً، تدعم هذه النتائج فكرة أن التعديل المنسق لـ mtNOS و Mn - superoxide dismutase يساهم في تحديد حالة اختزال دماغ الفئران والمشاركة في الفسيولوجيا الطبيعية لنمو الدماغ. تم وصف أشكال مختلفة من سينثاز أكسيد النيتريك للميتوكوندريا (mtNOS) في أنسجة الفئران والفئران، مثل الكبد والغدة الصعترية والعضلات الهيكلية، ومؤخراً القلب والدماغ. يؤدي تعديل هذه المتغيرات حسب حالة الغدة الدرقية أو نقص الأكسجة أو نقص الجينات إلى فتح مجموعة واسعة من الوظائف الخاصة بالأنسجة المعتمدة على mtNOS. في هذه الدراسة، تم وصف متغير NOS جديد في دماغ الفئران مع Mr من 144 kDa وموضع بشكل رئيسي في الغشاء الميتوكوندريا الداخلي. أثناء نضج دماغ الفئران، كان تعبير ونشاط mtNOS أقصى في المراحل الجنينية المتأخرة وأيام ما بعد الولادة المبكرة متبوعًا بانخفاض التعبير في مرحلة البلوغ (100 ± 9 مقابل 19 ± 2 pmol من [3H]سيترولين/دقيقة/ملغ من البروتين، على التوالي). كان هذا النمط الزمني معاكسًا لنمط البروتين الخلوي 157 - kDa nNOS. تبعت تغيرات اختزال الميتوكوندريا الاختلافات في نشاط mtNOS: كان الإنتاج المعتمد على mtNOS لبيروكسيد الهيدروجين أقصى ما يمكن في الأطفال حديثي الولادة وانخفض بشكل ملحوظ في مرحلة البلوغ، مما يعكس إنتاج واستخدام أكسيد النيتريك المصفوفة الميتوكوندريا. علاوة على ذلك، اتبع نشاط ديسموتاز المنجنيز الفائق في الدماغ نمطًا تنمويًا مشابهًا لنمط mtNOS. أظهرت الخلايا الحبيبية المخيخية المعزولة عن الفئران حديثي الولادة وذات النشاط العالي mtNOS معدلات انتشار قصوى، والتي انخفضت عن طريق تعديل مستويات إما بيروكسيد الهيدروجين أو أكسيد النيتريك. إجمالاً، تدعم هذه النتائج الفكرة القائلة بأن التعديل المنسق لـ mtNOS و Mn - superoxide dismutase يساهم في تحديد حالة اختزال دماغ الفئران والمشاركة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي لتطور الدماغ. nitric - oxide synthase nitric oxide tetrakis (4 - benzoic acid) porphyrin phosphate - buffered saline embryonic postnatal في السنوات الأخيرة، تم الإبلاغ عن حدوث سينثاز أكسيد النيتريك (NOS)1 المتغيرات الموجودة في الميتوكوندريا (mtNOS): تم اكتشاف بروتين iNOS في الكبد و thymus والقلب (1Givi C. Podos. J. BJoverisiol. Chem. 1998; 273: 11038-11043 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 2Bustamante J. Bersier G. Badin R.A. Cymering C. Parodi A. Boveris A. Nitric Oxide. 2002 ؛ 6: 333-341 Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar، 3French S. Giulivi C. Balaban R.S. Am. J. Physiol. 2001; 280: H2863 - H2867PubMed Google Scholar)، تم العثور على eNOS في العضلات الهيكلية للفئران والكبد (4Stamler J.S. Meissner G. Physiol. Rev. 2001; 81: 209-237 Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar, 5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. بيول. ميد. 2001 ؛ 31: 1609-1615 تم وصف Crossref PubMed Scopus (126) الباحث العلمي من Google)، و nNOS في العضلات الهيكلية للفئران (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282 - H2288PubMed Google Scholar) وقلب الفأر (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ؛ 98: 14126-14131 Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). وبالتالي، يبدو أن عائلة mtNOS تغطي مجموعة واسعة من البروتينات المختلفة من الناحية الهيكلية والمناعية التي يمكن أن تنتج عن تعديلات النسخ أو الترجمة التي تسمح باستهدافها للميتوكوندريا. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن اختلافات بين mtNOS وأشكال NOS الأيزو الكلاسيكية: يُظهر الكبد mtNOS تسلسل حمض أميني مشابه لـ iNOS (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 9Lopez MF Kristal B.S. Chernokalskaya E. Lazarev A. Shestopalov A.I. Bogdanova A. Robinson M. Electrophoresis. 2000 ؛ 21: 3427-3440 Crossref PubMed Scopus (191) الباحث العلمي من Google)، وإن كان ذلك بنمط أسيلة مميز (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar )؛ يعتمد نشاط mtNOS دائمًا على Ca2 + و calmodulin، حتى عندما يكون مرتبطًا مناعيًا بـ iNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282 - H2288PubMed Google Scholar )؛ وقد لوحظ نمط حركي متميز لـ mtNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). mtNOS يبدو أنه يمتلك وظائف تتكيف مع الاحتياجات الخاصة بالأنسجة. لدعم هذه الفكرة، يتم تعديل أنشطة mtNOS في الكبد والعضلات الهيكلية من خلال حالة الغدة الدرقية (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282 - H2288PubMed Google Scholar)، وتلك الموجودة في الدماغ والكبد يتم تعديلها بنقص الأكسجة (5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 1609-1615 Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). علاوة على ذلك، يتم تعديل مستوى تعبير mtNOS من خلال نشاط أو نقص جينات معينة، مثل الديستروفين في القلب (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y.، De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ؛ 98: 14126-14131 Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). يوفر تنظيم mtNOS نظرة جديدة على الأهمية الفسيولوجية لـ ⋅NO والميتوكوندريا في بيولوجيا الخلايا. من المعروف أن ⋅NO يرتبط بأوكسيديز السيتوكروم ذو الألفة العالية، ويعدل امتصاص الأكسجين (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92 Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 11Brown G.C. Copper C.E. FEBS Lett. 1994 ؛ 356: 295-298 Crossref PubMed Scopus (952) الباحث العلمي من Google)، ويزيد من إنتاج الميتوكوندريا لأنيون الأكسيد الفائق (O 2)، واعتمادًا على مصفوفة الميتوكوندريا Mn - superoxide مستويات ديسموتاز، من بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92 Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. كيم. 1999 ؛ 274: 37709-37716 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (172) الباحث العلمي من Google). وفقًا لذلك، يمكن أن يتبع تنشيط mtNOS زيادة في معدل إنتاج H2O2 للميتوكوندريا (13Sarkela TM Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi CJ Biol. كيم. 2001 ؛ 276: 6945-6949 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (115) الباحث العلمي من Google). يشارك H2O2، المتولد بهذه الطريقة، في تنظيم العمليات الخلوية المختلفة: في الدماغ، يمكن أن يشارك في شبكات الإشارات الخلوية أثناء تكوين المشابك واللدونة المبكرة (14Yermolaieva O. Brot N. Weissbach H. Heinemann S.H. Hoshi T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ؛ 97: 448-453 Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar) ؛ علاوة على ذلك، بعد تنشيط mtNOS، قد يلعب إنتاج الأكسدة المتفاقم دورًا في إشارات الاستماتة (15Ghafourifar P. Bringold U. Klein S.D. Richter C. Biol. استقبال الإشارات. 2001 ؛ 10: 57-65 Crossref PubMed Scopus (87) الباحث العلمي من Google). بشكل مميز، يتم التعبير عن nNOS ومتغيرات لصق الجين thenNOS مع توطين الخلايا الفرعية المميزة بشكل مختلف خلال الحياة الجنينية (16 إلياسون م. بلاكشو س. شيل م. ج. سنايدر ش. بروك. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997 ؛ 94: 3396-3401 Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) وترتبط بالتطور الطبيعي للدماغ (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995 ؛ 9: 799-806 Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). كانت هذه الدراسات تهدف إلى تحليل حدوث نشاط NOS الموضعي في الميتوكوندريا الدماغية، وملفها التطوري، وتأثيره على استقلاب الأكسدة. تم تعزيز الأهمية الفسيولوجية لهذه الدراسات من خلال نهج تجريبي يهدف إلى توفير علاقة بين إنتاج الميتوكوندريا لـ ⋅NO و H2O2 وتكاثر الخلايا العصبية. 3 - Amino -1,2,4 - triazole, aprotinin, l - arginine, bovine serum albumin, calmodulin, catalase, CHAPS, Cu,Zn superoxide dismutase, cytochrome c, dithiothreitol, EDTA, FAD, FMN, glutathione, HEPES, horseradish peroxidase, hydrogen peroxide, KCN, leupeptin, NADPH, NG - monomethyl - l - arginine (l - NMMA), ovomucoid, Percoll, phenylmethylsulfonyl fluoride, p - hydroxy - phenyl acetic acid, poly - d - lysine, scrose, tetrahydrobiopterin, Tris, trypsin, xanthine, and xanthine oxidase were from Sigma. Mn(III) tetrakis (4 - benzoic acid) porphyrin chloride (Mn(III) TBAP) كان من Cayman Chemical (Ann Arbor، MI)، و DNase كان من Roche Molecular Biochemicals. كان N - Acetyl cysteine هدية من الدكتور دانيال كولومباري (مختبرات بوين، بوينس آيرس، الأرجنتين). الأجسام المضادة أحادية النسيلة NOS المضادة للعصبونات (1095-1289)، NOS المضادة للبطانة متعددة النسائل، و iNOS المضادة للضمور متعددة النسائل كانت من مختبرات النقل (ليكسينغتون، كنتاكي )؛ NOS المضادة للعصبونات متعددة النسائل (1409-1429) و NOS المضادة للعصبونات أحادية النسيلة (1–181) كانت من Sigma. l -[2،3، -3H] كان أرجينين من PerkinElmer Life Sciences. كانت محاليل الأكريلاميد، وأغشية البولي فينيلدين ثنائي الفلوريد، والأجسام المضادة للفئران والأجسام المضادة للغلوبولين المناعي G المضادة للأرانب، ومجموعةImmun - Star ® من Bio - Rad. تم الحصول على محاليل أكسيد النيتريك (1.2–1.8 مم) عن طريق فقاعة غاز ⋅NO إلى نقاء 99.9 ٪ (AGA Gas Inc.، Maumee، OH) في الماء منزوع الغاز مع الهيليوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتخزينها لمدة أسبوع عند 4 درجات مئوية. تم التضحية بفئران ويستار البالغة عن طريق قطع الرأس، وتمت إزالة الدماغ أو المخيخ بسرعة وتجانسه في 320 مم سكروز/20 مم هيبس، ودرجة الحموضة 7.2، التي تحتوي على 1 مم إدتا، 1 مم ديثيوثريتول، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 2 ميكروغرام/مل بروتينين، و 10 ميكروغرام/مل فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد. بالنسبة للتجارب التطورية، تم تجميع الدماغ أو المخيخ الذي تم تشريحه من الأجنة (n = 15–30) أو حيوانات حديثي الولادة من مختلف الأعمار (n = 5–10). تمت تنقية الميتوكوندريا والجسيمات المشبكية بواسطة الطرد المركزي المتدرج بيركول كما هو موضح (1 جيوليفي سي بوديروسو جيه جيه بوفيريس إيه جيه بيول. Chem. 1998; 273: 11038-11043 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar) في منطقة عازلة تتكون من 0.23m مانيتول، و 0.07 m سكروز، و 0.5 mmEGTA، و 2 mm HEPES، ودرجة الحموضة 7.4. تم الحصول على الكسر الخلوي بعد طرد 100000 × جم من المادة الطافية 8000 × جم من متجانسات الدماغ. باستثناء التجارب التي أجريت في وجود بروتيناز K، والتي تتطلب ميتوكوندريا سليمة، وعزل جزيئات الخضوع، تم إجراء جميع التحديدات باستخدام الميتوكوندريا المجمدة/المذابة مرة واحدة. تم تجميد الميتوكوندريا المنقاة بالبيرول وذوبانها ثلاث مرات ثم صوتنتها مرتين عند 40 واط باستخدام سونيكاتور كول- بارمر (WPI، ساراسوتا، فلوريدا). بعد ذلك، تم طرد العينات مركزيًا لمدة 10 دقائق عند 8000 ×جم لترسيب الميتوكوندريا غير المكسورة، ثم تم طرد المادة الطافية مركزيًا لمدة 30 دقيقة عند 100000 × جم. تم فصل المادة الطافية (الجزء القابل للذوبان) عن الحبيبات (الأغشية)، وتم تعليق الأخيرة في 0.25 msucrose، 10 mm HEPES، pH 7.4، تحتوي على 2 mm dithiothreitol و 20 mm CHAPS وحضنت لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية تحت اهتزاز لطيف. ثم تم طرد المستحضر مركزيًا لمدة 30 دقيقة عند 100000 × جم، وتم فصل المادة الطافية (الجزء القابل للذوبان في CHAPS) والحبيبات (الجزء غير القابل للذوبان في CHAPS) وتخزينها عند -70 درجة مئوية حتى استخدامها. ⋅ تم تقييم إنتاج NO من خلال تحويل [3H]l - arginine إلى [3H] l - citrulline كما هو موضح سابقًا (18Knowles R. Salter M. Titheradge M. بروتوكولات أكسيد النيتريك. Human Press, Totowa, NJ1998: 67-73 Google Scholar) مع تعديلات طفيفة. تم قياس أنشطة الميتوكوندريا والخلوية في فوسفات البوتاسيوم 50 مم، ودرجة الحموضة 7.2، في وجود إما 120 ميكرومتر (الميتوكوندريا) أو 20 ميكرومتر (سيتوسول) لتر أرجينين، و 100 ميكرومتر من نافدة، و 0.1 ميكرومتر من كاليمودولين، و 0.3 ملليمتر من كلوريد الكالسيوم، و 1 ميكرومتر من البدعة، و 1 ميكرومتر من FMN، و 10 ميكرومتر من رباعي هيدروبيوبتيرين، و 100 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا. تم حساب النشاط النوعي عن طريق طرح النشاط المتبقي في وجود تركيز زائد بمقدار 10 أضعاف لمثبط سينسيز أكسيد النيتريك NMMA. تم تعليق الميتوكوندريا المنقاة في 4 ٪ فورمالدهايد محضر حديثًا من بارافورمالدهايد في PBS، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ثم تم تجفيفها في 70 و 96 و 100 ٪ إيثانول (30 دقيقة لكل خطوة) ومضمنة في LR White. تم الحصول على الشرائح بسكاكين زجاجية ووضعها على شبكات النيكل فوق أغشية Formvar. تم إجراء الكيمياء المناعية باستخدام أرنب أولي مضاد للطرف C nNOS (1409-1429) بتخفيف 1:100 في PBS، الأس الهيدروجيني 7.4. بعد الغسيل بـ PBS، تم استخدام مصل الماعز المضاد للأرانب المقترن بالذهب الغرواني (جسيمات قطرها 10 نانومتر) بتخفيف 1:100 في PBS، ودرجة الحموضة 7.4. تم غسل الشبكات مرة أخرى في PBS وتلطيخها قليلاً بنسبة 1 ٪ من أسيتات اليورانيل في الماء لمدة 5 دقائق. تم حظر الخلفية غير المحددة عن طريق احتضان الشبكات مع 5 ٪ من مصل الماعز العادي في PBS في بداية الإجراء. لوحظت عينات في مجهر إلكتروني لنقل ZEISS EM -109 - T عند 80 كيلو فولت. تمت مراقبة إنتاج H2O2 باستمرار في مقياس الطيف Hitachi F -2000 (Hitachi Ltd.، Tokyo، Japan) بأطوال موجية للإثارة والانبعاثات عند 315 و 425 نانومتر، على التوالي (19White RJ Reynolds I.J. J. Neurosci. 1996 ؛ 16: 5688-5697 Crossref PubMed Google Scholar). تألف وسط الاختبار من سكروز 25 مم، و 5 مم مجم كل 2، و 20 مم كلوريد الكالسيوم، و 10 مم بوكس 4 ك 2، و 20 مم هيبس، ودرجة الحموضة 7.4، وتم استكماله بـ 12.5 وحدة/مل من بيروكسيديز الفجل، و 50 ميكرومتر من حمض هيدروكسي فينيل أسيتيك، و 0.1 ملغ من بروتين الميتوكوندريا/مل مع 6 مم سكسينات كركيزة. لاستكشاف آثار نشاط ⋅NO و mtNOS على معدل إنتاج H2O2 للميتوكوندريا، تم بدء الفحص عن طريق إضافة إما 0.1 ملليلتر من الأرجينين أو نبضة من ⋅NO أو 2 ميكرومتر. لتقييم معدلات إنتاج H2O2 المحددة المعتمدة على mtNOS، تمت إضافة 1 ملليمتر - NMMA إلى مستحضرات الميتوكوندريا في الحالات المناسبة. لتقييد الاضمحلال التأكسدي لـ intramitochondrial ⋅NO، تم إجراء فحوصات عند حوالي 70 ميكرومتر من ثاني أكسيد الكربون. تعزى جميع الاختلافات الفلورية في الظروف المختلفة إلى H2O2 حيث تم تثبيطها تمامًا عن طريق المكملات مع 3 ميكرومكاتالاز. لجعل الحد الأقصى لمعدل إنتاج H2O2 موحدًا، تم استكمال مستحضرات الميتوكوندريا بـ 1 مم من محاكاة ديسموتاز الفائق الأكسيد Mn(III) TBAP. تم فحص أنشطة اختزال NADH - cytochrome c و succinate - cytochrome c (المجمعات I - III والمجمعات II و III، على التوالي) بقياس الطيف الضوئي من خلال تحديد اختزال السيتوكروم c عند 550 نانومتر في وجود 30 ميكرومتر من السيتوكروميك، 1 مم من KCN، وإما 150 ميكرومتر من NADH أو 8 مم من السكسينات كمانحين للإلكترون. تم تحديد نشاط أوكسيديز السيتوكروم (المركب الرابع) من خلال تسجيل أكسدة 50 ميكرومتر من السيتوكروم المخفض c في مطياف هيتاشي 3000 عند 550 نانومتر ؛ ε 550 = 21 مم-1 سم-1 (20Wharton D.C. Tzagoloff A. Methods Enzymol. 1967 ؛ 10: 245-250 Crossref Scopus (1331) الباحث العلمي من Google). تم تحديد معدل التفاعل على أنه ثابت التفاعل الزائف من الدرجة الأولى (k') وتم التعبير عنه على أنه الحد الأدنى-1 ملغ من البروتين-1. تم تحديد محتوى اليوبيكوينون في الميتوكوندريا المعزولة عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (المياه) مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية عند 275 نانومتر بعد الاستخلاص باستخدام الهكسان الحلقي: الإيثانول 1 (5:2) (6 ملغ من بروتين الميتوكوندريا/مل و 7 مل من الهكسان الحلقي:الإيثانول) (21Lang J.K. Gohil K. Packer L. الشرج. Biochem. 1986 ؛ 157: 106-116 Crossref PubMed Scopus (466) الباحث العلمي من Google). تم تحديد أنشطة ديسموتاز Mn - و Cu، Zn - superoxide بشكل طيفي عن طريق قياس تثبيط تقليل السيتوكروميك بواسطة نظام أكسيد الزانثين/الزانثين، كما هو موضح سابقًا (22McCord J.M. Fridovich I. J. Biol. Chem. 1969; 244: 6049-6055 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). باختصار، تم اتباع معدل تخفيض 10 ميكرومتر من السيتوكروم c بمقدار 3.5 ميكرون/مل من أوكسيديز الزانثين و 50 ميكرومتر من الزانثين في غياب (أساسي) أو وجود 100 ميكروغرام من البروتينات الخلوية أو الميتوكوندريا. تم تثبيط كل من أوكسيديز السيتوكروم و Cu، Zn - superoxide dismutase بواسطة 1 مم KCN. تم حساب وحدات ديسموتاز الأكسيد الفائق في كل جزء عن طريق الاستقراء من منحنى المعايرة مع ديسموتاز النحاس التجاري المعاير، Zn - superoxide. تم فصل سوائل 100 ميكروغرام من البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي على تقليل 6 ٪ من المواد الهلامية SDS - polyacrylamide ونقلها إلى أغشية البولي فينيلدين ثنائي الفلوريد. تم غسل الأغشية باستخدام 0.1 ٪ توين 20 في 20 مم محلول ملحي مخفف بالتريس، ودرجة الحموضة 7.4، وتم حظرها باستخدام 4 ٪ حليب غير دسم. تم تحضين الأغشية بأول جسم مضاد (1 ساعة، 1:1000 تخفيف)، وغسلها، ثم تحضينها بعد ذلك بجسم مضاد ثانوي للماعز أو مضاد للأرنب IgG مقترن بالفوسفاتيز القلوي (1 ساعة، 1:3000 تخفيف). تم الكشف عن العصابات عن طريق التلألؤ الكيميائي باستخدام Immun - Star ® (Bio - Rad). تم إجراء القياس الكمي للنطاقات من خلال تحليل الصور الرقمية باستخدام ماسح ضوئي من Hewlett - Packard وبرنامج محلل Totallab (الديناميكيات غير الخطية، الديناميكا الحيوية). تم الحصول على مزارع الخلايا الحبيبية المخيخية كما هو موضح سابقًا (23 Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998; 107: 43-48 Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). تم قطع رأس فئران Sprague - Dawley البالغة من العمر خمسة أيام، وتم تشريح المخيخ في محلول Krebs - Ringer مكمل بـ 6 جم/لتر من الجلوكوز. تم القضاء على السحايا، وتم تقطيع الأنسجة إلى قطع 1 مم واحتضانها في محلول ملحي يحتوي على 0.025 ٪ تريبسين، 1.2 مم MgSO4، و 3 ملغ/مل من ألبومين مصل البقر لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر. تم إيقاف الهضم الإنزيمي بمخاطية بيضوية (مثبط التربسين)، وتم فصل النسيج ميكانيكياً بماصات باستور بقطرين مختلفين (25 ضربة) في مخاطية بيضوية تحتوي على محلول ملحي و 0.01 ٪ DNase. تم طرد معلق الخلية مركزيًا عند 150 ×جم لمدة 10 دقائق، وتم إعادة تعليق الكرية في وسط زراعة الخلية (عصبي قاعدي، إنفيتروجين). تم تلقيح الخلايا على 96 بئرًا متعددًا (300000 خلية/بئر) مغلفة ببولي دي ليسين (الوزن الجزيئي 300000) في وسط خالٍ من المصل مكمل بـ B27 (إنفيتروجين). تم زرع الخلايا على 96 بئرًا متعددًا، وبعد ساعتين، تم تحضينها بـ [3H]ثيميدين (1 ملي كوري/مل) لمدة 22 ساعة. تم إجراء العلاجات الدوائية في وقت واحد مع إضافة [3H]ثيميدين. تعطلت الخلايا تناضحيًا من خلال حضانة مدتها دقيقتان بالماء المقطر مرتين وتم حصادها باستخدام حصادة خلايا Nunc مقترنة بمرشحات الألياف الزجاجية (Whatman، GF/C) كما هو موضح سابقًا (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998; 107: 43-48 Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). تم غسل المرشحات سبع مرات بالماء المجفف وسُمح لها بالجفاف طوال الليل. تم حساب النشاط الإشعاعي في عداد وميض سائل β. [3H]تم التعبير عن دمج الثيميدين كنسبة (التحكم التجريبي)/التحكم. تم استخدام اختبار t للطالب وتحليل الانحدار الخطي حسب الاقتضاء ؛ تم قبول الدلالة الإحصائية عند p < 0.05. تم تقييم نشاط NOS في الخلايا الخلوية في دماغ الفئران، والجسيمات المشبكية، والميتوكوندريا المنقاة (TableI). في العينات التي تم الحصول عليها من الفئران البالغة، يمثل النشاط الموجود في جزء الميتوكوندريا حوالي 10 ٪ من نشاط nNOS الخلوي. تم تأكيد تنقية الميتوكوندريا من العضيات ذات خصائص الترسيب المماثلة من خلال قياس النسبة بين أنشطة سكسينات- سيتوكروم سي ريدكتيز (علامة الميتوكوندريا) والفوسفاتاز الحمضي (علامة الليزوزومات). تم إثراء المستحضرات الميتوكوندريا المستخدمة خلال هذه الدراسة بحوالي 30 ضعفًا في علامات الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك، أكدنا نقاء وسلامة الميتوكوندريا عن طريق المجهر الإلكتروني. توزيع الجدول لنشاط سينثاز أكسيد النيتريك في أنسجة الدماغالجزءالنشاط النوعيPmol 3H - citrulline/min/mg من البروتينالمستوى الخلويCytosol 180 ± 16Synaptosomes54 ± 4Mitochondria17 ± 1Submitochondrial levelSoluble2 ± 0.1Membranes60 ± 4CHAPS - soluble fraction43 ± 4CHAPS - insoluble fraction252 ± 19 تم الحصول على الكسور المختلفة كما هو موضح تحت عنوان "المواد والطرق." البيانات هي وسيلة لثلاث تجارب مختلفة (معبراً عنها بمتوسط ± SE). افتح الجدول في علامة تبويب جديدة تم الحصول على الكسور المختلفة كما هو موضح تحت عنوان "المواد والطرق." البيانات هي وسيلة لثلاث تجارب مختلفة (معبراً عنها بمتوسط ± SE). لم يتأثر نشاط NOS بالمعالجة المسبقة للميتوكوندريا السليمة مع بروتيناز K، مما يشير إلى أنه لم يكن نتاجًا للتلوث الخلوي وأن البروتين كان موضعيًا داخل العضيات. وفقًا لذلك، بعد تجزئة الجسيمات المرسلة، تم إثراء نشاط NOS بمقدار 18 ضعفًا في جزء الغشاء، والذي كان يتكون أساسًا من غشاء الميتوكوندريا الداخلي (جزء CHAPS غير القابل للذوبان) (الجدول الأول). كان نشاط mtNOS الدماغي يعتمد على رباعي هيدروبيوبتيرين، Ca2 +/calmodulin، و NADPH، وبدرجة أقل، على الفلافينات (الشكل 1)، كما ورد سابقًا لـ nNOS. كما تم تثبيط نشاط NOS للميتوكوندريا الذي يمثل النشاط الحساس لـ N G - monomethyl - l - arginine بواسطة مثبطات NOSNG - nitro - l - arginine و 7 - nitroindazol و N - iminoethyl - l - ornithine ومثبط الفلافوبروتين، ثنائي فينيل اليودونيوم. أسفرت الدراسات الحركية الأولية عن Km واضح مماثل لـ mtNOS و nNOS (2–12 ميكرومتر). لم يلاحظ nNOS الخلوي (157 كيلو دالتون) في الميتوكوندريا ؛ بدلاً من ذلك، تم اكتشاف نطاق من M r ≈ 144 كيلو دالتون بواسطة جسمين مضادين لـ nNOS موجهين إلى المجال الطرفي C (anti nNOS 1409-1429 و anti nOS 1095-1289) ولكن ليس بواسطة أجسام مضادة موجهة إلى الجزء الطرفي N (anti nNOS 1–181) (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك، لم يتفاعل البروتين 144 - kDa مع الأجسام المضادة لـ eNOS أو الأجسام المضادة لـ iNOS (الشكل 2 أ). ألغى الجسم المضاد ضد موقع ربط NADPH لـ nNOS (anti - nOS 1095-1289) نشاط NOS في الميتوكوندريا، في حين لم يفعل ذلك anti - nOS 1409-1429 ولا anti - nOS 1–181، مما يؤكد هوية النطاق (الشكل. 2 ب). أظهر الجزء المشبكي، الأطراف العصبية الطرفية التي تحتوي على الميتوكوندريا المشبكية، نطاقًا مزدوجًا من بروتينات nNOS (157 كيلو دالتون) و mtNOS (144 كيلو دالتون) (الشكل 2 ج). تم استخدام الكشف المحدد عن mtNOS بواسطة anti - nNOS 1409-1429 لتقييم توطين mtNOS على المستوى البنيوي الفائق عن طريق الفحص المجهري المناعي الإلكتروني. في هذه الظروف، تم الكشف عن جزيئات الذهب الغروية بوضوح في الميتوكوندريا (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك، كانت مستويات الخلفية منخفضة، ولم تظهر العينات التي تمت معالجتها باستخدام مصل الأرانب الطبيعي كأجسام مضادة أولية أي علامات، مما يؤكد خصوصية التفاعل. أظهرت دراسة أكثر تفصيلاً للتوطين البنيوي الفائق للإنزيم في الميتوكوندريا باستخدام تخفيف أعلى للمصل الأول أن الملصقات كانت موجودة بشكل أساسي في الوجه الداخلي للغشاء الداخلي للميتوكوندريا، وبدرجة أقل، في مصفوفة الميتوكوندريا. (الشكل 3 ب). تم الإبلاغ عن زيادة تنظيم متغير 144 - kDa nNOS في الجسيمات المشبكية للفئران في وقت مبكر بعد الولادة (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995 ؛ 9: 799-806 Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). في هذه الدراسة، تم تناول التعبير (الشكل 4) والنشاط (الشكل 5) من mtNOS في دماغ الأجنة والحيوانات الوليدة بالتوازي مع nNOS الخلوي على النحو التالي. (أ) تم اكتشاف نشاط وتعبير nNOS الخلوي بشكل خافت في اليوم الجنيني 15 و 19 وزاد بعد الولادة ليصل إلى ذروته في الأسبوعين الثاني والثالث بعد الولادة (الشكل 4 أ) (كما ورد سابقًا (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995 ؛ 9: 799-806 Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar)). (ب) أظهر نشاط mtNOS نمطًا تنمويًا مختلفًا: كان تعبيره ونشاطه مرتفعين طوال الفترة الجنينية المتأخرة (الشكل 4 ب ؛ E15 - E19) حتى الأسبوع الأول بعد الولادة (الشكل. 4 ب ؛ P0 - P6) وانخفضت بشكل ملحوظ بعد هذا العمر. وهكذا، في P0، كان تعبير بروتين mtNOS ونشاطه أعلى بنحو 6 أضعاف من قيم البالغين المقابلة. يعزى تعديل نشاط mtNOS إلى التغيرات في تعبير البروتين، كما هو مستنتج من النسب ذات الصلة (الشكل 5). علاوة على ذلك، اتبعت mtNOS نمطًا تنمويًا مشابهًا في المخيخ، على الرغم من استمرار النشاط المرتفع حتى اليوم التالي للولادة 15 (الشكل 5، أدخل). (ج) سمحت لنا الدراسات التي أجريت على الجزء المشبكي بمراقبة التعديل المشترك لكل من mtNOS و nNOS: في هذا التحضير، كان mtNOS من الميتوكوندريا المشبكية فريدًا على ما يبدو خلال الأيام الأربعة الأولى ؛ بعد هذه النقطة الزمنية، يمكن اكتشاف كلا الإنزيمين (الشكل 4 ج). الشكل 5 الأنشطة الخاصة بتخليق أكسيد النيتريك أثناء نمو دماغ الفئران. تم قياس الأنشطة الخاصة بأكسيد النيتريك أثناء النمو في كسور الدماغ الخلوية والميتوكوندريا الموصوفة في وسيلة الإيضاح للشكل 4 ووفقًا لـ "المواد والطرق"." INSET، نشاط سينثاز أكسيد النيتريك للميتوكوندريا أثناء نضج مخيخ الفئران بعد الولادة. تشير الأسهم إلى لحظة الولادة. View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) في أنسجة الفئران المختلفة، ⋅NO تحفز زيادة في معدلات إنتاج الميتوكوندريا O 2 و H2O2 من خلال الآليات التي تنطوي على تثبيط نقل الإلكترون في الجزء الأول من القالب (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92 Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar) وأكسدة اليوبيكوينول المرتبط بالغشاء (التفاعل 1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar, 13 Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6945-6949 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar, 24Riobó N.A. Clementi E. Melani M. Boveris A. Cadenas E. Moncada S. Poderoso J.J. Biochem. J. 2001 ؛ 359: 139-145 Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) متبوعًا بالتأكسد التلقائي لـ ubisemiquinone (التفاعل 2). UQH−+⋅NO→UQ⋅−+NO− REACTION1 UQ2? +O2→UQ+O2? REACTION2 أظهر إنتاج H2O2 بواسطة كل من الميتوكوندريا الدماغية لحديثي الولادة والبالغين P2 -4 استجابة ثنائية الطور لـ⋅NO (الشكل 6). يتم تحديد المنحدرات الصاعدة والهابطة للمنحنيات من خلال النسبة النسبية للتفاعلين المتنافسين (التفاعلان 3 و 4) اللذان يدفعان مصفوفة الميتوكوندريا O 2 إلى H 2 O 2 (التي يحفزها Mn - superoxide dismutase ؛ التفاعل 3 ؛k 3 = 2 × 109m −1 s −1) أو ONOO −(عن طريق التفاعل مع ⋅NO ؛ التفاعل 4 ؛ k 4 = 1.9 × 1010m − 1s −1) (12 بوديروسو JJ Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. كيم. 1999 ؛ 274: 37709-37716 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (172) الباحث العلمي من Google). O2+O2 + H2O2+O2→REACTION3O2 +⋅NO ONOO − REACTION4→ تم تحقيق معدلات إنتاج H2O2 قصوى قابلة للمقارنة (0.4–0.5 نانومول/دقيقة/ملغ من البروتين) عند 0.1 ميكرومتر⋅NO في البالغين وعند 0.2 ميكرومتر⋅NO في حديثي الولادة (الشكل. 6). بالإضافة إلى ذلك، كان إجمالي اليوبيكينون أقل بنسبة 20 ٪ في الميتوكوندريا من حديثي الولادة منه في البالغين. كانت أنشطة تقليل اليوبيكينون في المجمعات من الأول إلى الثالث والمجمعات من الثاني إلى الثالث وكذلك نشاط المركب الرابع أقل بنسبة 45-50 ٪ في حديثي الولادة من تلك الموجودة في الحيوانات البالغة (الجدول الثاني). قد تفسر هذه البيانات التركيز المرتفع ⋅NO المطلوب في الميتوكوندريا لحديثي الولادة لاستنباط معدل إنتاج H2O2 مماثل لذلك الموجود في الميتوكوندريا البالغة. الجدول II أنشطة مجمع الميتوكوندريا ومحتوى اليوبيكوينون في الدماغ من الفئران حديثي الولادة والبالغين I - IIIII - IIV [UQ9] nmoles cyt c/min/mg من البروتين ′ min/mg من البروتين ميكروغرام/ملغ من البروتينNewborn 185 ± 2142 ± 99 ± 2408 ± 1Adult337 ± 2081 ± 1718 ± 5522 ± 3 المضاعفات I - III، NADH - cytochrome c reductase، المجمعات II - III، سكسينات- cytochrome c reductase ؛ المركب IV، أكسدة السيتوكروم. UQ9، ubiquinone. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± S.E. من خمس إلى عشر تجارب مختلفة. جدول مفتوح في علامة تبويب جديدة المجمعات I - III، NADH - cytochrome c reductase، المجمعات II - III، succinate - cytochrome c reductase ؛ المركب IV، أوكسيديز السيتوكروم. UQ9،

Translated Description (French)

Différentes isoformes de l'oxyde nitrique synthase mitochondriale (mtNOS) ont été décrites dans les tissus de rats et de souris, tels que le foie, le thymus, le muscle squelettique et, plus récemment, le cœur et le cerveau. La modulation de ces variants par le statut thyroïdien, l'hypoxie ou la déficience génique ouvre un large spectre de fonctions tissulaires spécifiques dépendantes de mtNOS. Dans cette étude, un nouveau variant nos est décrit dans le cerveau de rat avec un M r de 144 kDa et principalement localisé dans la membrane mitochondriale interne. Au cours de la maturation cérébrale du rat, l'expression et l'activité de mtNOS étaient maximales aux stades embryonnaires tardifs et aux premiers jours postnataux, suivies d'une diminution de l'expression au stade adulte (100 ± 9versus 19 ± 2 pmol de [3H]citrulline/min/mg de protéine, respectivement). Ce schéma temporel était opposé à celui de la protéine nNOS cytosolique de 157 kDa. Les changements d'oxydoréduction mitochondriale ont suivi les variations de l'activité de mtNOS : la production de peroxyde d'hydrogène dépendante de mtNOS était maximale chez les nouveau-nés et diminuait nettement au stade adulte, reflétant ainsi la production et l'utilisation de l'oxyde nitrique de la matrice mitochondriale. De plus, l'activité de la Mn-superoxyde dismutase cérébrale a suivi un schéma de développement similaire à celui de la mtNOS. Les cellules granulaires cérébelleuses isolées de rats nouveau-nés et présentant une activité mtNOS élevée présentaient des taux de prolifération maximaux, qui étaient diminués en modifiant les niveaux de peroxyde d'hydrogène ou d'oxyde nitrique. Dans l'ensemble, ces résultats soutiennent l'idée qu'une modulation coordonnée de la mtNOS et de la Mn-superoxyde dismutase contribue à établir le statut redox du cerveau du rat et à participer à la physiologie normale du développement du cerveau. Différentes isoformes de l'oxyde nitrique synthase mitochondriale (mtNOS) ont été décrites dans les tissus de rats et de souris, tels que le foie, le thymus, le muscle squelettique et, plus récemment, le cœur et le cerveau. La modulation de ces variants par le statut thyroïdien, l'hypoxie ou la déficience génique ouvre un large spectre de fonctions tissulaires spécifiques dépendantes de mtNOS. Dans cette étude, un nouveau variant nos est décrit dans le cerveau de rat avec un M r de 144 kDa et principalement localisé dans la membrane mitochondriale interne. Au cours de la maturation cérébrale du rat, l'expression et l'activité de mtNOS étaient maximales aux stades embryonnaires tardifs et aux premiers jours postnataux, suivies d'une diminution de l'expression au stade adulte (100 ± 9versus 19 ± 2 pmol de [3H]citrulline/min/mg de protéine, respectivement). Ce schéma temporel était opposé à celui de la protéine nNOS cytosolique de 157 kDa. Les changements d'oxydoréduction mitochondriale ont suivi les variations de l'activité de mtNOS : la production de peroxyde d'hydrogène dépendante de mtNOS était maximale chez les nouveau-nés et diminuait nettement au stade adulte, reflétant ainsi la production et l'utilisation de l'oxyde nitrique de la matrice mitochondriale. De plus, l'activité de la Mn-superoxyde dismutase cérébrale a suivi un schéma de développement similaire à celui de la mtNOS. Les cellules granulaires cérébelleuses isolées de rats nouveau-nés et présentant une activité mtNOS élevée présentaient des taux de prolifération maximaux, qui étaient diminués en modifiant les niveaux de peroxyde d'hydrogène ou d'oxyde nitrique. Dans l'ensemble, ces résultats soutiennent l'idée qu'une modulation coordonnée de la mtNOS et de la Mn-superoxyde dismutase contribue à établir le statut redox du cerveau du rat et à participer à la physiologie normale du développement cérébral. oxyde nitrique synthase oxyde nitrique endothélial oxyde nitrique synthase inductible oxyde nitrique synthase synthase mitochondriale oxyde nitrique synthase neuronal oxyde nitrique synthase peroxynitrite (3-[(3-cholamidopropyl) diméthyl-ammonio]-1-propanesulfonate) NG-monométhyl-l-arginine tétrakis (acide 4-benzoïque) porphyrine phosphate tampon salin embryonnaire postnatal Au cours des dernières années, l'apparition de variantes de l'oxyde nitrique synthase (nos)1 situées dans les mitochondries (mtNOS) a été signalée : une protéine iNOS a été détectée dans le foie et le thymus de rat et le cœur de porc (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 2Bustamante J. Bersier G. Badin R.A. Cymering C. Parodi A. Boveris A. Nitric Oxide. 2002 ; 6: 333-341Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 3French S. Giulivi C. Balaban R.S. Am. J. Physiol. 2001 ; 280 : H2863-H2867PubMed Google Scholar), eNOS a été trouvé dans le muscle squelettique et le foie de rat (4Stamler J.S. Meissner G. Physiol. Rev. 2001 ; 81: 209-237Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar, 5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001 ; 31: 1609-1615Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar), et nNOS a été décrit dans le muscle squelettique de rat (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001 ; 281 : H2282-H2288PubMed Google Scholar) et le cœur de souris (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ; 98: 14126-14131Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). Ainsi, la famille mtNOS semble couvrir un large spectre de protéines structurellement et immunologiquement différentes qui pourraient résulter de modifications transcriptionnelles ou traductionnelles qui leur permettent d'être ciblées sur les mitochondries. Cependant, des différences entre mtNOS et les isoformes classiques de nos ont été rapportées : le foie mtNOS présente une séquence d'acides aminés similaire à iNOS (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 9Lopez M.F. Kristal B.S. Chernokalskaya E. Lazarev A. Shestopalov A.I. Bogdanova A. Robinson M. Electrophoresis. 2000 ; 21: 3427-3440Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar), mais avec un motif d'acylation distinctif (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11044-11048Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar) ; l'activité de mtNOS dépend invariablement du Ca2+ et de la calmoduline, même lorsqu'elle peut être immunologiquement liée à iNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A.J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001 ; 281 : H2282-H2288PubMed Google Scholar) ; et un schéma cinétique distinct a été observé pour mtNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11038-11043Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11044-11048Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). mtNOS semble posséder des fonctions adaptées aux besoins spécifiques des tissus. À l'appui de cette notion, les activités mtNOS dans le foie et le muscle squelettique sont modulées par le statut thyroïdien (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001 ; 281 : H2282-H2288PubMed Google Scholar), et ceux du cerveau et du foie sont modulés par l'hypoxie (5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001 ; 31: 1609-1615Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). De plus, le niveau d'expression de mtNOS est modifié par l'activité ou la déficience de gènes spécifiques, tels que la dystrophine dans le cœur (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001 ; 98: 14126-14131Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). La régulation de mtNOS fournit un nouvel aperçu de la signification physiologique de ⋅NO et des mitochondries en biologie cellulaire. Il est bien connu que ⋅NO se lie à la cytochrome oxydase avec une grande affinité, module l'absorption d'O2 (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996 ; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 11Brown G.C. Copper C.E. FEBS Lett. 1994 ; 356: 295-298Crossref PubMed Scopus (952) Google Scholar), et augmente la production mitochondriale d'anion superoxyde (O 2), et en fonction des niveaux de matrice mitochondriale Mn-superoxyde dismutase, de peroxyde d'hydrogène (H2O2) (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996 ; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). En conséquence, l'activation de mtNOS pourrait être suivie d'une augmentation du taux de production de H2O2 mitochondrial (13Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C.J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 6945-6949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar). H2O2, généré de cette manière, est impliqué dans la régulation de différents processus cellulaires : dans le cerveau, il pourrait participer aux réseaux de signalisation cellulaire au cours de la synaptogenèse et de la plasticité précoces (14Yermolaieva O. Brot N. Weissbach H. Heinemann S.H. Hoshi T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ; 97: 448-453Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar) ; en outre, suite à l'activation de mtNOS, une production d'oxydant exacerbée peut jouer un rôle dans la signalisation apoptotique (15Ghafourifar P. Bringold U. Klein S.D. Richter C. Biol. Signals Recept. 2001 ; 10: 57-65Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar). De manière caractéristique, les variants nNOS et d'épissage du gène thenNOS avec des localisations subcellulaires distinctives sont exprimés différemment au cours de la vie embryonnaire (16Eliasson M. Blackshaw S. Schell M.J. Snyder S.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997 ; 94: 3396-3401Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) et sont liés au développement normal du cerveau (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995 ; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). Ces études visaient à analyser la survenue d'une activité nos localisée dans les mitochondries cérébrales, son profil de développement et son influence sur le métabolisme rédox. La signification physiologique de ces études a été renforcée par une approche expérimentale visant à établir une relation entre la production mitochondriale de ⋅NO et H2O2 et la prolifération des neurones. 3-Amino-1,2,4-triazole, aprotinine, l-arginine, albumine sérique bovine, calmoduline, catalase, CHAPS, Cu,Zn superoxyde dismutase, cytochrome c, dithiothréitol, EDTA, FAD, FMN, glutathion, HEPES, peroxydase de raifort, peroxyde d'hydrogène, KCN, leupeptine, NADPH,N G-monométhyl-l-arginine (l-NMMA), ovomucoïde, Percoll, fluorure de phénylméthylsulfonyle, acide p-hydroxy-phényl acétique, poly-d-lysine, saccharose, tétrahydrobioptérine, Tris, trypsine, xanthine et xanthine oxydase provenaient de Sigma. Le chlorure de Mn(III) tétrakis (acide 4-benzoïque) porphyrine (Mn(III) TBAP) provenait de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) et la DNase de Roche Molecular Biochemicals. La N-acétyl cystéine était un cadeau du Dr Daniel Colombari (Laboratoires Poen, Buenos Aires, Argentine). Les anticorps monoclonaux anti-neuronaux nos (1095-1289), anti-endothéliaux polyclonaux nos et anti-macrophages polyclonaux iNOS provenaient de Transduction Laboratories (Lexington, KY) ; les anticorps polyclonaux anti-neuronaux nos (1409-1429) et monoclonaux anti-neuronaux nos (1–181) provenaient de Sigma. l-[2,3,-3H]Arginine provenait de PerkinElmer Life Sciences. Les solutions d'acrylamide, les membranes de difluorure de polyvinylidène, les anticorps anti-IgG de souris et anti-IgG de lapin et le kit Immun-Star ® provenaient de Bio-Rad. Des solutions d'oxyde nitrique (1,2-1,8 mm) ont été obtenues par barbotage⋅ de gaz NO à 99,9 % de pureté (AGA Gas Inc., Maumee, OH) dans de l'eau dégazée à l'hélium pendant 30 min à température ambiante et stockée pendant une semaine à 4 °C. Les rats Wistar adultes ont été sacrifiés par décapitation, et le cerveau ou le cervelet a été rapidement retiré et homogénéisé dans 320 mm de saccharose/20 mm HEPES, pH 7,2, contenant 1 mm d'EDTA, 1 mm de dithiothréitol, 10 μg/ml de leupeptine, 2 μg/ml d'aprotinine et 10 μg/ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle. Pour les expériences de développement, le cerveau ou le cervelet disséqué à partir d'embryons (n = 15–30) ou d'animaux nouveau-nés de différents âges (n = 5–10) a été regroupé. Les mitochondries et les synaptosomes ont été purifiés par centrifugation à gradient de Percoll comme décrit (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A.J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 11038-11043Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar) dans un tampon composé de 0,23m mannitol, 0,07 m saccharose, 0,5 mmEGTA et 2 mm HEPES, pH 7,4. La fraction cytosolique a été obtenue après centrifugation de 100 000 × g du surnageant de 8 000 × g d'homogénats cérébraux. À l'exception des expériences en présence de protéinase K, qui nécessitaient des mitochondries intactes, et de l'isolement de particules submochondriales, toutes les déterminations ont été effectuées à l'aide de mitochondries une fois congelées/décongelées. Les mitochondries purifiées au percoll ont été congelées et décongelées trois fois, puis soniquées deux fois à 40 watts avec un sonicateur Cole-Parmer (WPI, Sarasota, FL). Par la suite, les échantillons ont été centrifugés pendant 10 min à 8 000 ×g pour précipiter les mitochondries intactes, puis le surnageant a été centrifugé pendant 30 min à 100 000 × g. Le surnageant (fraction soluble) a été séparé du culot (membranes), et ce dernier a été mis en suspension dans 0,25 msucrose, 10 mm HEPES, pH 7,4, contenant 2 mm de dithiothréitol et 20 mm CHAPS et incubé pendant 20 min à 4 °C sous agitation douce. La préparation a ensuite été centrifugée pendant 30 min à 100 000 × g, et le surnageant (fraction soluble dans CHAPS) et le culot (fraction insoluble dans CHAPS) ont été séparés et stockés à -70 °C jusqu'à utilisation. ⋅aucune production n'a été évaluée par la conversion de la [3H]l-arginine en [3H] l-citrulline comme décrit précédemment (18Knowles R. Salter M. Titheradge M. Nitric Oxide Protocols. Human Press, Totowa, NJ1998: 67-73Google Scholar) avec des modifications mineures. Les activités mitochondriales et cytosoliques ont été mesurées dans du phosphate de potassium de 50 mm, pH 7,2, en présence de 120 μm (mitochondries) ou de 20 μm (cytosol) de l-arginine, de 100 μm d'ANDPH, de 0,1 μm de calmoduline, de 0,3 mm de CaCl2, de 1 μm de FAD, de 1 μm de FMN, de 10 μm de tétrahydrobioptérine et de 100 μg de protéine mitochondriale. L'activité spécifique a été calculée en soustrayant l'activité restante en présence d'une concentration 10 fois supérieure de l'inhibiteur de l'oxyde nitrique synthase NMMA. Des mitochondries purifiées ont été mises en suspension dans du formaldéhyde à 4% fraîchement préparé à partir de paraformaldéhyde dans du PBS, pH 7,4, pendant 2 h à 4 °C, puis déshydratées dans de l'éthanol à 70, 96 et 100% (30 min pour chaque étape) et incorporées dans du LR White. Des lames ont été obtenues avec des couteaux en verre et placées sur des grilles de nickel sur des membranes Formvar. L'immunocytochimie a été réalisée en utilisant un nNOS primaire anti C-terminal de lapin (1409-1429) à une dilution de 1:100 dans du PBS, pH 7,4. Après lavage au PBS, un sérum de chèvre anti- lapin conjugué à de l'or colloïdal (particules de 10 nm de diamètre) a été utilisé à une dilution de 1:100 dans du PBS, pH 7,4. Les grilles ont été lavées à nouveau dans du PBS et légèrement contre-colorées avec 1% d'acétate d'uranyle dans de l'eau pendant 5 min. Le fond non spécifique a été bloqué en incubant les grilles avec 5% de sérum de chèvre normal dans du PBS au début de la procédure. Des échantillons ont été observés dans un microscope électronique à transmission Zeiss EM-109-T à 80 kV. La production de H2O2 a été surveillée en continu dans un spectrofluoromètre Hitachi F-2000 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japon) avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission à 315 et 425 nm, respectivement (19White R.J. Reynolds I.J. J. Neurosci. 1996 ; 16: 5688-5697Crossref PubMed Google Scholar). Le milieu de dosage était composé de 25 mm de saccharose, 5 mmMgCl2, 20 mm KCl, 10 mmPO4K2 et 20 mm HEPES, pH 7,4, et il a été complété avec 12,5 unités/ml de peroxydase de raifort, 50 μm d'acide p-hydroxyphénylacétique et 0,1 mg de protéine mitochondriale/ml avec 6 mm de succinate comme substrat. Pour explorer les effets de l'activité ⋅NO et mtNOS sur le taux de production de H2O2 mitochondrial, le test a été initié par une supplémentation avec 0,1 mml-arginine ou une impulsion de ⋅NO ou 2 μmantimycine A. Pour évaluer les taux de production spécifiques de H2O2 dépendant de mtNOS, 1 mml-NMMA a été ajouté aux préparations mitochondriales dans les cas appropriés. Pour limiter la désintégration oxydative du ⋅NO intramitochondrial, des essais ont été effectués à environ 70 μmO2. Toutes les variations fluorométriques dans les différentes conditions étaient attribuables à H2O2 car elles étaient complètement inhibées par la supplémentation en 3 μmcatalase. Afin d'uniformiser le taux maximal de production de H2O2, des préparations mitochondriales ont été complétées avec 1 mm de TBAP mimétique de la superoxyde dismutase Mn(III). Les activités de la NADH-cytochrome c réductase et de la succinate-cytochrome c réductase (complexes I–III et complexes II et III, respectivement) ont été dosées par spectrophotométrie en déterminant la réduction du cytochrome c à 550 nm en présence de cytochromes de 30 μm, de KCN de 1 mm et de succinate de 150 μmNADH ou de 8 mm en tant que donneurs d'électrons. L'activité de la cytochrome oxydase (complexe IV) a été déterminée en enregistrant l'oxydation du cytochrome c réduit de 50 μm dans un spectrophotomètre Hitachi 3000 à 550 nm ; ε550 = 21 mm−1 cm−1 (20Wharton D.C. Tzagoloff A. Methods Enzymol. 1967 ; 10: 245-250Crossref Scopus (1331) Google Scholar). La vitesse de la réaction a été déterminée comme la constante de la pseudo réaction du premier ordre (k′) et exprimée en min−1 mg de protéine−1. La teneur en ubiquinone dans les mitochondries isolées a été déterminée par chromatographie liquide haute pression (Waters) avec détection UV à 275 nm après extraction au cyclohexane : ethano1 (5:2) (6 mg de protéine mitochondriale/ml et 7 ml de cyclohexane :éthanol) (21Lang J.K. Gohil K. Packer L. Anal. Biochem. 1986 ; 157: 106-116Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar). Les activités Mn- et Cu,Zn-superoxyde dismutase ont été déterminées par spectrophotométrie en mesurant l'inhibition de la réduction des cytochromes par le système xanthine/xanthine oxydase, comme décrit précédemment (22McCord J.M. Fridovich I.J. Biol. Chem. 1969 ; 244: 6049-6055Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Brièvement, le taux de réduction du cytochrome c de 10 μm par 3,5 microunits/ml de xanthine oxydase et 50 μm de xanthine a été suivi en l'absence (basale) ou en présence de 100 μg de protéines cytosoliques ou mitochondriales. La cytochrome oxydase et la Cu,Zn-superoxyde dismutase ont toutes deux été inhibées par 1 mm KCN. Les unités de superoxyde dismutase dans chaque fraction ont été calculées par extrapolation à partir d'une courbe d'étalonnage avec la titrée commerciale Cu,Zn-superoxyde dismutase. Des aliquotes de 100 μg de protéines ont été séparées par électrophorèse sur des gels de SDS-polyacrylamide à 6 % réducteurs et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Les membranes ont été lavées avec 0,1 % de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au tris de 20 mm, pH 7,4, et bloquées avec 4 % de lait écrémé. Les membranes ont été incubées avec le premier anticorps (1 h, dilution 1:1000), lavées, puis incubées avec un anticorps IgG secondaire de chèvre anti-souris ou anti-lapin conjugué à la phosphatase alcaline (1 h, dilution 1:3000). Les bandes ont été détectées par chimiluminescence à l'aide d'Immun-Star ® (Bio-Rad). La quantification des bandes a été réalisée par analyse d'image numérique à l'aide d'un scanner Hewlett-Packard et du logiciel d'analyse Totallab (Dynamique Non Linéaire, Biodynamique). Des cultures de cellules granulaires cérébelleuses ont été obtenues comme décrit précédemment (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998 ; 107: 43-48Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Des rats Sprague-Dawley âgés de cinq jours ont été décapités et des cerveaux ont été disséqués dans une solution de Krebs-Ringer supplémentée en glucose à 6 g/l. Les méninges ont été éliminées et les tissus coupés en morceaux de 1 mm et incubés dans une solution saline contenant 0,025 % de trypsine, 1,2 mm de MgSO4 et 3 mg/ml de sérum-albumine bovine pendant 15 min à 37 °C sous agitation continue. La digestion enzymatique a été arrêtée avec de l'ovomucoïde (inhibiteur de la trypsine), et le tissu a été dissocié mécaniquement avec des pipettes Pasteur de deux diamètres différents (25 coups) dans de l'ovomucoïde contenant de la solution saline et de la DNase à 0,01 %. La suspension cellulaire a été centrifugée à 150 xg pendant 10 min, et le culot a été remis en suspension dans du milieu de culture cellulaire (Neurobasal, Invitrogen). Les cellules ont été ensemencées sur 96 multi-puits (300 000 cellules/puits) recouverts de poly-d-lysine (poids moléculaire 300 000) dans un milieu sans sérum supplémenté en B27 (Invitrogen). Les cellules ont été ensemencées sur 96 multipuits, et après 2 h, elles ont été incubées avec de la [3H]thymidine (1 mCi/ml) pendant 22 h. Les traitements médicamenteux ont été effectués simultanément avec l'ajout de [3H]thymidine. Les cellules ont été osmotiquement perturbées par une incubation de 2 min avec de l'eau bidistillée et récoltées avec une moissonneuse de cellules Nunc couplée à des filtres en fibre de verre (Whatman, GF/C) comme décrit précédemment (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998 ; 107: 43-48Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Les filtres ont été lavés sept fois avec de l'eau bidistillée et laissés sécher toute la nuit. La radioactivité a été comptée dans un compteur β à scintillation liquide. L'incorporation de la [3H]thymidine a été exprimée par le rapport (témoin expérimental)/témoin. Le test t de Student et l'analyse de régression linéaire ont été utilisés selon le cas ; la signification statistique a été acceptée à p < 0,05. L'activité nos a été évaluée dans le cytosol cérébral de rat, les synaptosomes et les mitochondries purifiées (Tableau I). Dans des échantillons prélevés sur des rats adultes, l'activité présente dans la fraction mitochondriale représentait environ 10 % de celle des nNOS cytosoliques. La purification des mitochondries à partir d'organites ayant des propriétés de sédimentation similaires a été confirmée par la mesure du rapport entre les activités succinate-cytochrome c réductase (marqueur mitochondrial) et phosphatase acide (marqueur lysosomal). Les préparations mitochondriales utilisées tout au long de cette étude ont été enrichies d'environ 30 fois en marqueurs mitochondriaux. En outre, nous avons confirmé la pureté et l'intégrité des mitochondries par microscopie électronique. Tableau IDrépartition de l'activité de l'oxyde nitrique synthase dans le tissu cérébralFractionActivité spécifiquepmol 3H-citrulline/min/mg de protéineNiveau subcellulaireCytosol180 ± 16Synaptosomes54 ± 4Mitochondria17 ± 1Niveau submitochondrialSoluble2 ± 0,1Membranes60 ± 4Fraction soluble CHAPS43 ± 4Fraction insoluble CHAPS252 ± 19Les différentes fractions ont été obtenues comme décrit sous « Matériaux et méthodes.« Les données sont les moyennes de trois expériences différentes (exprimées en moyenne ± S.E.). Ouvrir la table dans un nouvel onglet Les différentes fractions ont été obtenues comme décrit sous « Matériels et Méthodes.« Les données sont les moyennes de trois expériences différentes (exprimées en moyenne ± S.E.). L'activité nos n'a pas été affectée par le prétraitement des mitochondries intactes avec la protéinase K, ce qui suggère qu'il ne s'agissait pas d'un produit de contamination cytosolique et que la protéine était localisée à l'intérieur des organites. En conséquence, après fractionnement des particules submitochondriales, l'activité nos a été enrichie de 18 fois dans la fraction membranaire, qui était principalement composée de la membrane mitochondriale interne (fraction insoluble dans les CHAPS) (Tableau I). L'activité du mtNOS cérébral était dépendante de la tétrahydrobioptérine, du Ca2+/calmoduline et du NADPH, et dans une moindre mesure, des flavines (Fig. 1), comme indiqué précédemment pour le nNOS. L'activité nos mitochondriale qui représentait l'activité sensible à la N G-monométhyl-l-arginine a également été inhibée par les inhibiteurs nos NG-nitro-l-arginine, le 7-nitroindazol et la N-iminoéthyl-l-ornithine et par l'inhibiteur de la flavoprotéine, le diphénylène iodonium. Les études cinétiques préliminaires ont donné un Km apparent similaire pour mtNOS et nNOS (2–12 μm). Le nNOS cytosolique (157 kDa) n'a pas été observé dans les mitochondries ; au lieu de cela, une bande de M r ≈ 144 kDa a été détectée par deux anticorps anti-nNOS dirigés contre le domaine C-terminal (anti-nNOS 1409-1429 et anti-nNOS 1095-1289) mais pas par des anticorps dirigés contre le segment N-terminal (anti-nNOS 1–181) (Fig.2 A). De plus, la protéine de 144 kDa n'a pas eu de réaction croisée avec les anticorps anti-eNOS ou anti-iNOS (Fig. 2 A). L'anticorps contre le site de liaison NADPH de nNOS (anti-nNOS 1095-1289) a aboli l'activité nos dans les mitochondries, alors que ni anti-nNOS 1409-1429 ni anti-nNOS 1–181 ne l'ont fait, confirmant ainsi l'identité de la bande (Fig. 2 B). La fraction synaptosomale, terminaisons nerveuses contenant des mitochondries synaptiques, présentait une double bande de protéines nNOS (157 kDa) et mtNOS (144 kDa) (Fig. 2 C). La détection spécifique de mtNOS par l'anti-nNOS 1409–1429 a été utilisée pour évaluer au moyen de la microscopie immuno-électronique la localisation de mtNOS au niveau ultrastructural. Dans ces conditions, des particules d'or colloïdales ont été clairement détectées dans les mitochondries (Fig. 3 A). De plus, les niveaux de fond étaient faibles et les échantillons traités avec du sérum de lapin normal comme anticorps primaire ne présentaient aucun marquage, confirmant ainsi la spécificité de la réaction. Une étude plus détaillée de la localisation ultrastructurale de l'enzyme dans les mitochondries en utilisant une dilution plus élevée du premier sérum a montré que le marquage était principalement situé dans la face interne de la membrane interne mitochondriale, et dans une moindre mesure, dans la matrice mitochondriale. (Fig. 3 B). La régulation positive d'un variant nNOS de 144 kDa dans les synaptosomes de rats a été signalée tôt après la naissance (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995 ; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). Dans cette étude, l'expression (Fig. 4) et l'activité (Fig. 5) de la mtNOS dans le cerveau des embryons et des animaux nouveau-nés en parallèle de la nNOS cytosolique ont été abordées comme suit. (a) L'activité et l'expression de la nNOS cytosolique étaient faiblement détectables aux jours embryonnaires 15 et 19 et augmentaient après la naissance pour atteindre un pic vers les deuxième et troisième semaines postnatales (Fig. 4 A) (comme indiqué précédemment (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995 ; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar))). (b) L'activité de mtNOS a montré un schéma de développement différent : son expression et son activité ont été élevées tout au long de la période embryonnaire tardive (Fig. 4 B ; E15–E19) jusqu'à la première semaine postnatale (Fig. 4 B ; P0–P6) et a nettement diminué au-delà de cet âge. Ainsi, à P0, l'expression et l'activité de la protéine mtNOS étaient environ 6 fois plus élevées que les valeurs correspondantes chez l'adulte. La modulation de l'activité mtNOS a été attribuée à des changements dans l'expression des protéines, comme déduit des rapports respectifs (Fig. 5). De plus, mtNOS a suivi un schéma de développement similaire dans le cervelet, bien qu'une activité élevée ait persisté jusqu'au 15e jour postnatal (Fig. 5, encart). (c) Les études sur la fraction synaptosomale nous ont permis d'observer la co-modulation de mtNOS et de nNOS : dans cette préparation, mtNOS des mitochondries synaptiques était apparemment unique pendant les 4 premiers jours ; au-delà de ce point de temps, les deux enzymes ont pu être détectées (Fig.4 C).Figure 5Activités spécifiques à l'oxyde nitrique synthase pendant le développement du cerveau de rat. Les activités spécifiques de l'oxyde nitrique synthase au cours du développement ont été mesurées dans les fractions cytosoliques et mitochondriales du cerveau décrites dans la légende de la Fig. 4 et selon « Matériels et méthodes.« Inset, mitochondrial nitric-oxide synthase activity during postnatal maturation of rat cerebellum. Les flèches indiquent le moment de la naissance. Visionnez la grande image Figure ViewerDownload (PPT) Dans différents tissus de rat, ⋅NO induit une augmentation des taux de production mitochondriale d'O 2 et de H2O2 par des mécanismes impliquant l'inhibition du transfert d'électrons au niveau du segment bc 1 (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996 ; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar) et oxydation de l'ubiquinol lié à la membrane (réaction 1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 37709-37716Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar, 13Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C.J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 6945-6949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar, 24Riobó N.A. Clementi E. Melani M. Boveris A. Cadenas E. Moncada S. Poderoso J.J. Biochem. J. 2001 ; 359: 139-145Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) suivi d'une autoxydation de l'ubisemiquinone (Réaction 2). UQH−+⋅NO→UQ⋅−+NO− REACTION1 UQ2+O2→UQ+O2 ⋅ REACTION2La production de H2O2 par les mitochondries du cerveau néonatal et adulte P2–4 a montré une réponse biphasique à⋅NO (Fig. 6). Les pentes ascendantes et descendantes des courbes sont déterminées par le rapport relatif des deux réactions concurrentes (Réactions 3 et 4) qui conduisent la matrice mitochondriale O 2 à H2O2(catalysée par la Mn-superoxyde dismutase ; Réaction 3 ;k 3 = 2 × 109m−1 s−1) ou ONOO−(en réagissant avec ⋅NO ; Réaction 4 ; k 4 = 1,9 × 1010m−1s−1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A.J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). O2+O2 +2H +→ H2O2 + O2 REACTION3 O2 +⋅NO→ONOO− REACTION4 Des taux de production de H2O2 maximaux comparables (0,4-0,5 nmol/min/mg de protéine) ont été atteints à 0,1 μm⋅NO chez l'adulte et à 0,2 μm⋅NO chez le nouveau-né (Fig. 6). De plus, l'ubiquinone totale était ∼20% plus faible dans les mitochondries des nouveau-nés que dans celles des adultes. Les activités réductrices de l'ubiquinone des complexes I–III et des complexes II–III ainsi que l'activité du complexe IV étaient ∼45-50 % plus faibles chez les nouveau-nés que chez les animaux adultes (TableauII). Ces données peuvent expliquer la concentration de ⋅NO 2 fois plus élevée requise dans les mitochondries néonatales pour obtenir un taux de production de H2O2 similaire à celui des mitochondries adultes. Tableau IIActivités complexes mitochondriales et teneur en ubiquinone dans le cerveau de rats nouveau-nés et adultesI-IIIII-IIIIV [UQ9]nmoles cyt c/min/mg de proteink ′ min/mg de protéineμg/mg de protéineNouveau-né185 ± 2142 ± 99 ± 2408 ± 1Adult337 ± 2081 ± 1718 ± 5522 ± 3Complexes I–III, NADH-cytochrome c réductase, complexes II–III, succinate-cytochrome c réductase ; complexe IV, cytochrome oxydase. UQ9, ubiquinone. Les données sont exprimées en moyenne ± S.E. de cinq à dix expériences différentes. Table ouverte dans un nouvel onglet Complexes I–III, NADH-cytochrome c réductase, complexes II–III, succinate-cytochrome c réductase ; complexe IV, cytochrome oxydase. UQ9,

Translated Description (Spanish)

Se han descrito diferentes isoformas de la óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS) en tejidos de rata y ratón, como el hígado, el timo, el músculo esquelético y, más recientemente, el corazón y el cerebro. La modulación de estas variantes por el estado tiroideo, la hipoxia o la deficiencia génica abre un amplio espectro de funciones específicas de tejido dependientes de mtNOS. En este estudio, se describe una nueva variante de nos en cerebro de rata con una M r de 144 kDa y localizada principalmente en la membrana mitocondrial interna. Durante la maduración del cerebro de la rata, la expresión y la actividad de mtNOS fueron máximas en las etapas embrionarias tardías y los primeros días posnatales, seguidas de una disminución de la expresión en la etapa adulta (100 ± 9 frente a 19 ± 2 pmol de [3H]citrulina/min/mg de proteína, respectivamente). Este patrón temporal era opuesto al de la proteína nNOS citosólica de 157 kDa. Los cambios redox mitocondriales siguieron las variaciones en la actividad de mtNOS: la producción de peróxido de hidrógeno dependiente de mtNOS fue máxima en los recién nacidos y disminuyó notablemente en la etapa adulta, lo que refleja la producción y utilización de óxido nítrico de la matriz mitocondrial. Además, la actividad de la Mn-superóxido dismutasa cerebral siguió un patrón de desarrollo similar al de la mtNOS. Las células granulares cerebelosas aisladas de ratas recién nacidas y con alta actividad de mtNOS exhibieron tasas máximas de proliferación, que disminuyeron modificando los niveles de peróxido de hidrógeno u óxido nítrico. En conjunto, estos hallazgos respaldan la noción de que una modulación coordinada de mtNOS y Mn-superóxido dismutasa contribuye a establecer el estado redox del cerebro de rata y participa en la fisiología normal del desarrollo cerebral. Se han descrito diferentes isoformas de la óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS) en tejidos de rata y ratón, como el hígado, el timo, el músculo esquelético y, más recientemente, el corazón y el cerebro. La modulación de estas variantes por el estado tiroideo, la hipoxia o la deficiencia génica abre un amplio espectro de funciones específicas de tejido dependientes de mtNOS. En este estudio, se describe una nueva variante de nos en cerebro de rata con una M r de 144 kDa y localizada principalmente en la membrana mitocondrial interna. Durante la maduración del cerebro de la rata, la expresión y la actividad de mtNOS fueron máximas en las etapas embrionarias tardías y los primeros días posnatales, seguidas de una disminución de la expresión en la etapa adulta (100 ± 9 frente a 19 ± 2 pmol de [3H]citrulina/min/mg de proteína, respectivamente). Este patrón temporal era opuesto al de la proteína nNOS citosólica de 157 kDa. Los cambios redox mitocondriales siguieron las variaciones en la actividad de mtNOS: la producción de peróxido de hidrógeno dependiente de mtNOS fue máxima en los recién nacidos y disminuyó notablemente en la etapa adulta, lo que refleja la producción y utilización de óxido nítrico de la matriz mitocondrial. Además, la actividad de la Mn-superóxido dismutasa cerebral siguió un patrón de desarrollo similar al de la mtNOS. Las células granulares cerebelosas aisladas de ratas recién nacidas y con alta actividad de mtNOS exhibieron tasas máximas de proliferación, que disminuyeron modificando los niveles de peróxido de hidrógeno u óxido nítrico. En conjunto, estos hallazgos respaldan la noción de que una modulación coordinada de mtNOS y Mn-superóxido dismutasa contribuye a establecer el estado redox del cerebro de la rata y participa en la fisiología normal del desarrollo cerebral. óxido nítrico sintasa óxido nítrico endotelial óxido nítrico sintasa inducible por óxido nítrico sintasa mitocondrial óxido nítrico sintasa neuronal óxido nítrico sintasa peroxinitrito (3-[(3-colamidopropil) dimetil-amonio]-1-propanosulfonato) NG-monometil-l-arginina tetrakis (ácido 4-benzoico) porfirina fosfato solución salina tamponada embrionaria postnatal En los últimos años, se ha informado la aparición de variantes de óxido nítrico sintasa (nos)1 ubicadas en mitocondrias (mtNOS): se detectó una proteína iNOS en hígado y timo de rata y corazón de cerdo (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A.J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 2Bustamante J. Bersier G. Badin R.A. Cymering C. Parodi A. Boveris A. Nitric Oxide. 2002; 6: 333-341 Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 3French S. Giulivi C. Balaban R.S. Am. J. Physiol. 2001; 280: H2863-H2867PubMed Google Scholar), se encontró eNOS en músculo esquelético e hígado de rata (4Stamler J.S. Meissner G. Physiol. Rev. 2001; 81: 209-237Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar, 5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 1609-1615 Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar), y se describió nNOS en músculo esquelético de rata (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282-H2288PubMed Google Scholar) y corazón de ratón (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 14126-14131Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). Por lo tanto, la familia mtNOS parece cubrir un amplio espectro de proteínas estructural e inmunológicamente diferentes que podrían resultar de modificaciones transcripcionales o traduccionales que les permitan dirigirse a las mitocondrias. Sin embargo, se informaron diferencias entre mtNOS y las isoformas clásicas de nos: mtNOS hepática exhibe una secuencia de aminoácidos similar a iNOS (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 9Lopez M.F. Kristal B.S. Chernokalskaya E. Lazarev A. Shestopalov A.I. Bogdanova A. Robinson M. Electrophoresis. 2000; 21: 3427-3440 Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar), aunque con un patrón de acilación distintivo (8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar); la actividad de mtNOS depende invariablemente de Ca2+ y calmodulina, incluso cuando puede estar inmunológicamente relacionada con iNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A.J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282-H2288PubMed Google Scholar); y se ha observado un patrón cinético distinto para mtNOS (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A.J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar, 8Tatoyan A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11044-11048Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar). mtNOS parece poseer funciones adaptadas a las necesidades específicas del tejido. En apoyo de esta noción, las actividades de mtNOS en el hígado y el músculo esquelético están moduladas por el estado de la tiroides (6Carreras M.C. Peralta J.G. Converso D.P. Finocchietto P.V. Rebagliati I. Zaninovich A.A. Poderoso J.J. Am. J. Physiol. 2001; 281: H2282-H2288PubMed Google Scholar), y los del cerebro y el hígado están modulados por la hipoxia (5Lacza Z. Puskar M. Figueroa J.P. Zhang J. Rajapakse N. Busija D.W. Free Radic. Biol. Med. 2001; 31: 1609-1615 Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). Además, el nivel de expresión de mtNOS se modifica por la actividad o deficiencia de genes específicos, como la distrofina en el corazón (7Kanai A.J. Pearce L.L. Clemens P.R. Birder L.A. Van Bibber M.M. Choi S.Y., De Groat W.C. Peterson J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 14126-14131Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar). La regulación de mtNOS proporciona una nueva visión de la importancia fisiológica de ⋅NO y las mitocondrias en la biología celular. Es bien sabido que ⋅NO se une a la citocromo oxidasa con alta afinidad, modula la absorción de O2 (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 11Brown G.C. Copper C.E. FEBS Lett. 1994; 356: 295-298Crossref PubMed Scopus (952) Google Scholar), y aumenta la producción mitocondrial de anión superóxido (O 2), y dependiendo de los niveles de la matriz mitocondrial Mn-superóxido dismutasa, de peróxido de hidrógeno (H2O2) (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A.J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). En consecuencia, la activación de mtNOS podría ir seguida de un aumento en la tasa de producción de H2O2 mitocondrial (13Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C.J. Biol. Chem. 2001; 276: 6945-6949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar). El H2O2, generado de esta manera, está involucrado en la regulación de diferentes procesos celulares: en el cerebro, podría participar en las redes de señalización celular durante la sinaptogénesis temprana y la plasticidad (14Yermolaieva O. Brot N. Weissbach H. Heinemann S.H. Hoshi T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 448-453Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar); además, después de la activación de mtNOS, una producción de oxidante exacerbada puede desempeñar un papel en la señalización apoptótica (15Ghafourifar P. Bringold U. Klein S.D. Richter C. Biol. Signals Recept. 2001; 10: 57-65Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar). Característicamente, las variantes de nNOS y de empalme del gen thenNOS con localizaciones subcelulares distintivas se expresan diferencialmente durante la vida embrionaria (16Eliasson M. Blackshaw S. Schell M.J. Snyder S.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 3396-3401Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) y están relacionados con el desarrollo normal del cerebro (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). Estos estudios tenían como objetivo analizar la aparición de una actividad nos localizada en las mitocondrias cerebrales, su perfil de desarrollo y su influencia en el metabolismo redox. La importancia fisiológica de estos estudios se vio reforzada por un enfoque experimental destinado a proporcionar una relación entre la producción mitocondrial de ⋅NO y H2O2 y la proliferación neuronal. 3-amino-1,2,4-triazol, aprotinina, l-arginina, albúmina de suero bovino, calmodulina, catalasa, CHAPS, Cu,Zn superóxido dismutasa, citocromo c, ditiotreitol, EDTA, FAD, FMN, glutatión, HEPES, peroxidasa de rábano picante, peróxido de hidrógeno, KCN, leupeptina, NADPH,N G-monometil-l-arginina (l-NMMA), ovomucoide, Percoll, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ácido p-hidroxifenilacético, poli-d-lisina, sacarosa, tetrahidrobiopterina, Tris, tripsina, xantina y xantina oxidasa fueron de Sigma. El cloruro de Mn(III) tetrakis (ácido 4-benzoico) porfirina (Mn(III) TBAP) fue de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI), y la DNasa fue de Roche Molecular Biochemicals. La N-acetil cisteína fue un regalo del Dr. Daniel Colombari (Laboratorios Poen, Buenos Aires, Argentina). Los anticuerpos monoclonales anti-neuronales nos (1095-1289), policlonales anti-endoteliales nos y policlonales anti-macrófagos iNOS fueron de Transduction Laboratories (Lexington, KY); los policlonales anti-neuronales nos (1409-1429) y monoclonales anti-neuronales nos (1–181) fueron de Sigma. La l-[2,3,-3H]arginina fue de PerkinElmer Life Sciences. Las soluciones de acrilamida, las membranas de difluoruro de polivinilideno, los anticuerpos IgG anti-ratón y anti-conejo y el kit Immun-Star® fueron de Bio-Rad. Las soluciones de óxido nítrico (1.2–1.8 mm) se obtuvieron burbujeando⋅NO gas hasta una pureza del 99.9% (AGA Gas Inc., Maumee, OH) en agua desgasificada con helio durante 30 min a temperatura ambiente y almacenada durante una semana a 4 °C. Las ratas Wistar adultas se sacrificaron por decapitación, y el cerebro o el cerebelo se eliminaron rápidamente y se homogeneizaron en 320 mm de sacarosa/20 mm de HEPES, pH 7,2, que contenía 1 mm de EDTA, 1 mm de ditiotreitol, 10 μg/ml de leupeptina, 2 μg/ml de aprotinina y 10 μg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Para los experimentos de desarrollo, se agrupó el cerebro o el cerebelo diseccionado de embriones (n = 15–30) o animales recién nacidos de diferentes edades (n = 5–10). Las mitocondrias y los sinaptosomas se purificaron mediante centrifugación en gradiente de Percoll como se describe (1Giulivi C. Poderoso J.J. Boveris A.J. Biol. Chem. 1998; 273: 11038-11043Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (514) Google Scholar) en un tampón que consiste en 0,23m de manitol, 0,07 m de sacarosa, 0,5 mm de EGTA y 2 mm de HEPES, pH 7,4. La fracción citosólica se obtuvo después de 100.000 × g de centrifugación del sobrenadante de 8.000 × g de homogeneizados de cerebro. Excepto por los experimentos en presencia de proteinasa K, que requirieron mitocondrias intactas y el aislamiento de partículas submitocondriales, todas las determinaciones se realizaron utilizando mitocondrias una vez congeladas/descongeladas. Las mitocondrias purificadas con Percoll se congelaron y descongelaron tres veces y luego se sonicaron dos veces a 40 vatios con un sonicador Cole-Parmer (WPI, Sarasota, FL). Posteriormente, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 8.000 ×g para precipitar las mitocondrias intactas, y el sobrenadante se centrifugó durante 30 min a 100.000 × g. El sobrenadante (fracción soluble) se separó del sedimento (membranas), y este último se suspendió en 0.25 msacarosa, 10 mm HEPES, pH 7.4, que contenía 2 mm ditiotreitol y 20 mm CHAPS y se incubó durante 20 min a 4 °C con agitación suave. Luego, la preparación se centrifugó durante 30 min a 100,000 × g, y el sobrenadante (fracción soluble en CHAPS) y el sedimento (fracción insoluble en CHAPS) se separaron y almacenaron a -70 °C hasta su uso. ⋅ La producción de NO se evaluó mediante la conversión de [3H]l-arginina en [3H] l-citrulina como se describió anteriormente (18Knowles R. Salter M. Titheradge M. Nitric Oxide Protocols. Human Press, Totowa, NJ1998: 67-73Google Scholar) con modificaciones menores. Las actividades mitocondriales y citosólicas se midieron en fosfato de potasio de 50 mm, pH 7,2, en presencia de 120 μm (mitocondrias) o 20 μm (citosol) de l-arginina, 100 μm de NADPH, 0,1 μm de calmodulina, 0,3 mm de CaCl2, 1 μm de FAD, 1 μm de FMN, 10 μm de tetrahidrobiopterina y 100 μg de proteína mitocondrial. La actividad específica se calculó restando la actividad restante en presencia de una concentración en exceso de 10 veces del inhibidor de la óxido nítrico sintasa NMMA. Las mitocondrias purificadas se suspendieron en formaldehído al 4% recién preparado a partir de paraformaldehído en PBS, pH 7,4, durante 2 h a 4 °C y luego se deshidrataron en etanol al 70, 96 y 100% (30 min para cada etapa) y se incrustaron en LR White. Los portaobjetos se obtuvieron con cuchillos de vidrio y se colocaron en rejillas de níquel sobre membranas Formvar. La inmunocitoquímica se realizó utilizando una nNOS anti C-terminal primaria de conejo (1409-1429) a una dilución de 1:100 en PBS, pH 7.4. Después de lavar con PBS, se utilizó un suero de cabra anti-conejo conjugado con oro coloidal (partículas de 10 nm de diámetro) a una dilución de 1:100 en PBS, pH 7,4. Las rejillas se lavaron de nuevo en PBS y se contratiñeron ligeramente con acetato de uranilo al 1% en agua durante 5 min. El fondo inespecífico se bloqueó incubando las rejillas con suero de cabra normal al 5% en PBS al comienzo del procedimiento. Las muestras se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM-109-T a 80 kV. La producción de H2O2 se monitoreó continuamente en un espectrofluorómetro Hitachi F-2000 (Hitachi Ltd., Tokio, Japón) con longitudes de onda de excitación y emisión a 315 y 425 nm, respectivamente (19White R.J. Reynolds I.J. J. Neurosci. 1996; 16: 5688-5697 Crossref PubMed Google Scholar). El medio de ensayo consistió en 25 mm de sacarosa, 5 mm de MgCl2, 20 mm de KCl, 10 mm de PO4K2 y 20 mm de HEPES, pH 7,4, y se complementó con 12,5 unidades/ml de peroxidasa de rábano picante, 50 μm de ácido p-hidroxifenilacético y 0,1 mg de proteína mitocondrial/ml con 6 mm de succinato como sustrato. Para explorar los efectos de la actividad de ⋅NO y mtNOS en la tasa de producción de H2O2 mitocondrial, el ensayo se inició mediante la suplementación con 0.1 mml-arginina o un pulso de ⋅NO o 2 μmantimicina A. Para evaluar las tasas de producción de H2O2 específicas dependientes de mtNOS, se agregó 1 mml-NMMA a las preparaciones mitocondriales en los casos apropiados. Para restringir la descomposición oxidativa del ⋅NO intramitocondrial, los ensayos se llevaron a cabo a aproximadamente 70 μmO2. Todas las variaciones fluorométricas en las diferentes condiciones fueron atribuibles a H2O2 ya que fueron completamente inhibidas por la suplementación con 3 μmcatalasa. Para hacer uniforme la tasa de producción máxima de H2O2, las preparaciones mitocondriales se complementaron con 1 mm del mimético de superóxido dismutasa Mn(III) TBAP. Las actividades de NADH-citocromo c reductasa y succinato-citocromo c reductasa (complejos I–III y complejos II y III, respectivamente) se analizaron espectrofotométricamente mediante la determinación de la reducción del citocromo c a 550 nm en presencia de 30 μm citocromec, 1 mm KCN y 150 μm NADH o 8 mm succinato como donantes de electrones. La actividad de citocromo oxidasa (complejo IV) se determinó registrando la oxidación de 50 μm de citocromo c reducido en un espectrofotómetro Hitachi 3000 a 550 nm; ε550 = 21 mm−1 cm−1 (20Wharton D.C. Tzagoloff A. Methods Enzymol. 1967; 10: 245-250 Crossref Scopus (1331) Google Scholar). La velocidad de la reacción se determinó como la constante de reacción de pseudoprimer orden (k′) y se expresó como min−1 mg de proteína−1. El contenido de ubiquinona en mitocondrias aisladas se determinó mediante cromatografía líquida de alta presión (Waters) con detección UV a 275 nm después de la extracción con ciclohexano: etano1 (5:2) (6 mg de proteína mitocondrial/ml y 7 ml de ciclohexano:etanol) (21Lang J.K. Gohil K. Packer L. Anal. Biochem. 1986; 157: 106-116Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar). Las actividades de Mn- y Cu,Zn-superóxido dismutasa se determinaron espectrofotométricamente midiendo la inhibición de la reducción citocromecánica por el sistema xantina/xantina oxidasa, como se describió anteriormente (22McCord J.M. Fridovich I. J. Biol. Chem. 1969; 244: 6049-6055Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). En resumen, se siguió la tasa de reducción de 10 μm de citocromo c por 3.5 microunidades/ml de xantina oxidasa y 50 μm de xantina en ausencia (basal) o presencia de 100 μg de proteínas citosólicas o mitocondriales. Tanto la citocromo oxidasa como la Cu,Zn-superóxido dismutasa fueron inhibidas por 1 mm KCN. Las unidades de superóxido dismutasa en cada fracción se calcularon mediante extrapolación a partir de una curva de calibración con Cu,Zn-superóxido dismutasa comercial valorada. Se separaron alícuotas de 100 μg de proteína mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida al 6% reductores y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se lavaron con Tween 20 al 0,1% en solución salina tamponada con Tris de 20 mm, pH 7,4, y se bloquearon con leche descremada al 4%. Las membranas se incubaron con el primer anticuerpo (1 h, dilución 1:1000), se lavaron y posteriormente se incubaron con un anticuerpo IgG secundario de cabra anti-ratón o anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (1 h, dilución 1:3000). Las bandas se detectaron por quimioluminiscencia utilizando Immun-Star® (Bio-Rad). La cuantificación de las bandas se realizó mediante análisis de imágenes digitales utilizando un escáner Hewlett-Packard y un software analizador Totallab (Nonlinear Dynamics, Biodynamics). Los cultivos celulares de gránulos cerebelosos se obtuvieron como se describió anteriormente (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998; 107: 43-48Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Se decapitaron ratas Sprague-Dawley de cinco días de edad y se diseccionaron los cerebelos en solución de Krebs-Ringer suplementada con 6 g/l de glucosa. Se eliminaron las meninges y el tejido se cortó en trozos de 1 mm y se incubó en solución salina que contenía tripsina al 0,025%, MgSO4 1,2 mm y 3 mg/ml de albúmina de suero bovino durante 15 min a 37 °C con agitación continua. La digestión enzimática se detuvo con ovomucoide (inhibidor de tripsina) y el tejido se disoció mecánicamente con pipetas Pasteur de dos diámetros diferentes (25 golpes) en ovomucoide que contenía solución salina y ADNasa al 0,01%. La suspensión celular se centrifugó a 150 ×g durante 10 min, y el sedimento se resuspendió en medio de cultivo celular (Neurobasal, Invitrogen). Las células se inocularon en 96 multipocillos (300.000 células/pocillo) recubiertos con poli-d-lisina (peso molecular 300.000) en medio libre de suero suplementado con B27 (Invitrogen). Las células se sembraron en 96 multipocillos y, después de 2 h, se incubaron con [3H]timidina (1 mCi/ml) durante 22 h. Los tratamientos farmacológicos se realizaron simultáneamente con la adición de [3H]timidina. Las células se rompieron osmóticamente a través de una incubación de 2 minutos con agua bidestilada y se cosecharon con un recolector de células Nunc acoplado a filtros de fibra de vidrio (Whatman, GF/C) como se describió anteriormente (23Borodinsky L.N. Fiszman M.L. Dev. Brain Res. 1998; 107: 43-48Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Los filtros se lavaron siete veces con agua bidestilada y se dejaron secar durante la noche. La radiactividad se contó en un contador β de centelleo líquido. La incorporación de [3H]timidina se expresó como la relación (control experimental)/control. La prueba t de Student y el análisis de regresión lineal se utilizaron según corresponda; la significación estadística se aceptó a p < 0.05. La actividad de nos se evaluó en citosol cerebral de rata, sinaptosomas y mitocondrias purificadas (TablaI). En muestras obtenidas de ratas adultas, la actividad presente en la fracción mitocondrial representó alrededor del 10% de la de la nNOS citosólica. La purificación de las mitocondrias a partir de orgánulos con propiedades de sedimentación similares se confirmó midiendo la relación entre las actividades de succinato-citocromo c reductasa (marcador mitocondrial) y fosfatasa ácida (marcador lisosómico). Las preparaciones mitocondriales utilizadas a lo largo de este estudio se enriquecieron aproximadamente 30 veces en marcadores mitocondriales. Además, confirmamos la pureza y la integridad de las mitocondrias mediante microscopía electrónica. Tabla Distribución de la actividad de la óxido nítrico sintasa en el tejido cerebralFracciónActividad específicapmol 3H-citrulina/min/mg de proteínaNivel subcelularCitosol180 ± 16Sinaptosomas54 ± 4Mitocondrias17 ± 1Nivel submitocondrialSoluble2 ± 0.1Membranas60 ± 4CHAPSfracción soluble43 ± 4CHAPSfracción insoluble252 ± 19Las diferentes fracciones se obtuvieron como se describe en "Materiales y métodos." Los datos son las medias de tres experimentos diferentes (expresados como media ± SE). Abrir tabla en una nueva pestaña Las diferentes fracciones se obtuvieron como se describe en "Materiales y Métodos." Los datos son las medias de tres experimentos diferentes (expresados como media ± SE). La actividad de nos no se vio afectada por el pretratamiento de las mitocondrias intactas con proteinasa K, lo que sugiere que no era un producto de la contaminación citosólica y que la proteína estaba localizada dentro de los orgánulos. Por consiguiente, después del fraccionamiento de las partículas submitocondriales, la actividad de nos se enriqueció 18 veces en la fracción de membrana, que se componía principalmente de membrana mitocondrial interna (fracción insoluble en CHAPS) (Tabla I). La actividad de mtNOS en el cerebro dependía de la tetrahidrobiopterina, Ca2+/calmodulina y NADPH, y en menor medida, de las flavinas (Fig. 1), como se informó anteriormente para nNOS. La actividad nos mitocondrial que representaba la actividad sensible a N G-monometil-l-arginina también fue inhibida por los inhibidores nos NG-nitro-l-arginina, 7-nitroindazol y N-iminoetil-l-ornitina y por el inhibidor de flavoproteínas, difenileno yodonio. Los estudios preliminares de cinética arrojaron una K m aparente similar para mtNOS y nNOS (2–12 μm). No se observó nNOS citosólica (157 kDa) en las mitocondrias; en cambio, se detectó una banda de M r ≈ 144 kDa por dos anticuerpos anti-nNOS dirigidos al dominio C-terminal (anti-nNOS 1409-1429 y anti-nNOS 1095-1289) pero no por anticuerpos dirigidos al segmento N-terminal (anti-nNOS 1–181) (Fig.2 A). Además, la proteína de 144 kDa no reaccionó de forma cruzada con anticuerpos anti-eNOS o anti-iNOS (Fig. 2 A). El anticuerpo contra el sitio de unión a NADPH de nNOS (anti-nNOS 1095–1289) abolió la actividad de nos en las mitocondrias, mientras que ni anti-nNOS 1409-1429 ni anti-nNOS 1–181 lo hicieron, confirmando así la identidad de la banda (Fig. 2 B). La fracción sinaptosómica, terminales del extremo nervioso que contienen mitocondrias sinápticas, exhibió una doble banda de proteínas nNOS (157 kDa) y mtNOS (144 kDa) (Fig. 2 C). La detección específica de mtNOS por anti-nNOS 1409-1429 se utilizó para evaluar mediante microscopía inmunoelectrónica la localización de mtNOS a nivel ultraestructural. En estas condiciones, se detectaron claramente partículas de oro coloidal en las mitocondrias (Fig. 3 A). Además, los niveles de fondo eran bajos, y las muestras procesadas con suero de conejo normal como anticuerpo primario no mostraron ningún marcaje, confirmando así la especificidad de la reacción. Un estudio más detallado de la localización ultraestructural de la enzima en las mitocondrias utilizando una mayor dilución del primer suero mostró que el marcaje se encontraba principalmente en la cara interna de la membrana interna mitocondrial y, en menor medida, en la matriz mitocondrial. (Fig. 3 B). Se informó que la regulación positiva de una variante de nNOS de 144 kDa en sinaptosomas de rata ocurre temprano después del nacimiento (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar). En este estudio, la expresión (Fig. 4) y la actividad (Fig. 5) de mtNOS en el cerebro de embriones y animales recién nacidos en paralelo a nNOS citosólica se abordaron de la siguiente manera. (a) La actividad y la expresión de nNOS citosólica fueron ligeramente detectables en los días embrionarios 15 y 19 y aumentaron después del nacimiento hasta alcanzar su punto máximo alrededor de la segunda y tercera semanas posnatales (Fig. 4 A) (como se informó anteriormente (17Ogilvie P. Schilling K. Billingsley M. Schmidt H. FASEB J. 1995; 9: 799-806Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar)). (b) La actividad de mtNOS mostró un patrón de desarrollo diferente: su expresión y actividad se elevaron a lo largo del período embrionario tardío (Fig. 4 B; E15–E19) hasta la primera semana postnatal (Fig. 4 B; P0–P6) y disminuyó notablemente más allá de esta edad. Por lo tanto, en P0, la expresión y la actividad de la proteína mtNOS fueron aproximadamente 6 veces mayores que los valores adultos correspondientes. La modulación de la actividad de mtNOS se atribuyó a cambios en la expresión de proteínas, como se infiere de las proporciones respectivas (Fig. 5). Además, mtNOS siguió un patrón de desarrollo similar en el cerebelo, aunque la actividad elevada persistió hasta el día 15 posnatal (Fig. 5, recuadro). (c) Los estudios sobre la fracción sinaptosómica nos permitieron observar la comodulación de mtNOS y nNOS: en esta preparación, mtNOS de las mitocondrias sinápticas fue aparentemente única durante los primeros 4 días; más allá de este punto temporal, se pudieron detectar ambas enzimas (Fig.4 C). Figura 5 Actividades específicas de la óxido nítrico sintasa durante el desarrollo del cerebro de rata. Las actividades específicas de la óxido nítrico sintasa durante el desarrollo se midieron en las fracciones citosólicas y mitocondriales cerebrales descritas en la leyenda de la Fig. 4 y de acuerdo con "Materiales y métodos." Inset, mitocondrial nitric-oxide synthase activity during postnatal maturation of rat cerebellum. Las flechas indican el momento del nacimiento.Ver Figura de Imagen Grande VisorDescarga (PPT) En diferentes tejidos de rata, ⋅NO induce un aumento de las tasas de producción mitocondrial de O 2 y H2O2 por mecanismos que implican la inhibición de la transferencia de electrones en el segmento bc 1 (10Poderoso J.J. Carreras M.C. Lisdero C. Riobó N. Schöpfer F. Boveris A. Arch. Biochem. Biophys. 1996; 328: 85-92Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar) y oxidación de ubiquinol unido a membrana (Reacción 1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar, 13Sarkela T.M. Berthiaume J. Elfering S. Gybina A.A. Giulivi C. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6945-6949Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (115) Google Scholar, 24Riobó N.A. Clementi E. Melani M. Boveris A. Cadenas E. Moncada S. Poderoso J.J. Biochem. J. 2001; 359: 139-145 Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar) seguido de autooxidación de ubisemiquinona (Reacción 2). UQH−+⋅NO→UQ⋅−+NO− REACCIÓN1 UQ2 = +O2→UQ+O2 = REACCIÓN2La producción de H2O2 por parte de las mitocondrias cerebrales tanto neonatales como adultas P2–4 mostró una respuesta bifásica a⋅NO (Fig. 6). Las pendientes ascendentes y descendentes de las curvas están determinadas por la relación relativa de las dos reacciones competidoras (Reacciones 3 y 4) que impulsan la matriz mitocondrial O 2 a H2O2(catalizada por Mn-superóxido dismutasa; Reacción 3;k 3 = 2 × 109m−1 s−1) u ONOO−(reaccionando con ⋅NO; Reacción 4; k 4 = 1.9 × 1010m−1s−1) (12Poderoso J.J. Lisdero C. Schöpfer F. Riobó N. Carreras M.C. Cadenas E. Boveris A.J. Biol. Chem. 1999; 274: 37709-37716Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (172) Google Scholar). O2+O2 +→ H2O2+ O2 REACTION3 O2 +⋅NO→ONOO− REACTION4Las tasas máximas comparables de producción de H2O2 (0.4–0.5 nmol/min/mg de proteína) se lograron a 0.1 μm⋅NO en adultos y a 0.2 μm⋅NO en neonatos (Fig. 6). Además, la ubiquinona total fue ~20% menor en las mitocondrias de los neonatos que en las de los adultos. Las actividades reductoras de ubiquinona de los complejos I–III y los complejos II–III, así como la actividad del complejo IV, fueron ~45–50% menores en neonatos que en animales adultos (TablaII). Estos datos pueden explicar la concentración de ⋅NO 2 veces mayor requerida en las mitocondrias neonatales para provocar una tasa de producción de H2O2 similar a la de las mitocondrias adultas. Tabla IIActividades del complejo mitocondrial y contenido de ubiquinona en el cerebro de ratas recién nacidas y adultasI-IIIII-IIIIV [UQ9]nmoles cyt c/min/mg de proteink ′ min/mg de proteinμg/mg de proteinNewborn185 ± 2142 ± 99 ± 2408 ± 1Adulto337 ± 2081 ± 1718 ± 5522 ± 3Complejos I–III, NADH-citocromo c reductasa, complejos II–III, succinato-citocromo ctasa; complejo IV, citocromo oxidasa. UQ9, ubiquinona. Los datos se expresan como media ± SE de cinco a diez experimentos diferentes. Tabla abierta en una nueva pestaña Complejos I–III, NADH-citocromo c reductasa, complejos II–III, succinato-citocromo c reductasa; complejo IV, citocromo oxidasa. UQ9,

Files

pdf.pdf

Files (16.0 kB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:d21255a0a0a7dcabce6a4e733a220bc6
16.0 kB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تعديل نشاط سينثاز أكسيد النيتريك الميتوكوندريا في نمو دماغ الفئران
Translated title (French)
La modulation de l'activité de l'oxyde nitrique synthase mitochondriale dans le développement du cerveau de rat
Translated title (Spanish)
La modulación de la actividad de la óxido nítrico sintasa mitocondrial en el desarrollo del cerebro de rata

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2089439333
DOI
10.1074/jbc.m204580200

Is supplement to
https://openalex.org/W3029155473 (Other)
https://openalex.org/W247954563 (Other)
https://openalex.org/W2392311598 (Other)
https://openalex.org/W2369406526 (Other)
https://openalex.org/W2167021117 (Other)
https://openalex.org/W2098776639 (Other)
https://openalex.org/W2050559178 (Other)
https://openalex.org/W2028156322 (Other)
https://openalex.org/W2002027447 (Other)
https://openalex.org/W1998792901 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
Argentina

References

  • https://openalex.org/W1532078988
  • https://openalex.org/W1550986239
  • https://openalex.org/W1598727061
  • https://openalex.org/W1775613062
  • https://openalex.org/W1940436875
  • https://openalex.org/W1957992664
  • https://openalex.org/W1967391135
  • https://openalex.org/W1974335287
  • https://openalex.org/W2002518891
  • https://openalex.org/W2008422233
  • https://openalex.org/W2008680254
  • https://openalex.org/W2018740639
  • https://openalex.org/W2019531751
  • https://openalex.org/W2028407281
  • https://openalex.org/W2030142800
  • https://openalex.org/W2030496404
  • https://openalex.org/W2045099525
  • https://openalex.org/W2046522511
  • https://openalex.org/W2047545717
  • https://openalex.org/W2065967387
  • https://openalex.org/W2070235240
  • https://openalex.org/W2081595932
  • https://openalex.org/W2081947989
  • https://openalex.org/W2082921983
  • https://openalex.org/W2083600400
  • https://openalex.org/W2085576934
  • https://openalex.org/W2090929775
  • https://openalex.org/W2094120111
  • https://openalex.org/W2095410649
  • https://openalex.org/W2118826001
  • https://openalex.org/W2141258007
  • https://openalex.org/W2143445854
  • https://openalex.org/W226431089
  • https://openalex.org/W25771616
  • https://openalex.org/W2901937269
  • https://openalex.org/W336932610
  • https://openalex.org/W4300653795
  • https://openalex.org/W962061814