Published September 4, 2018
| Version v1
Publication
Open
Alanine Scanning Mutagenesis of the C-Terminal Cytosolic End of Gpm6a Identifies Key Residues Essential for the Formation of Filopodia
Creators
- 1. Instituto Tecnológico de Chascomús
- 2. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
- 3. National University of General San Martín
Description
Neuronal membrane glycoprotein M6a (Gpm6a) is a protein with four transmembrane regions and the N- and the C-ends facing the cytosol. It functions in processes of neuronal development, outgrowth of neurites, and formation of filopodia, spines, and synapsis. Molecular mechanisms by which Gpm6a acts in these processes are not fully comprehended. Structural similarities of Gpm6a with tetraspanins led us to hypothesize that, similarly to tetraspanins, the cytoplasmic tails function as connections with cytoskeletal and/or signaling proteins. Here, we demonstrate that the C- but not the N-terminal cytosolic end of Gpm6a is required for the formation of filopodia by Gpm6a in cultured neurons from rat hippocampus and in neuroblastoma cells N2a. Further immunofluorescence microcopy and flow cytometry analysis show that deletion of neither the N- nor the C-terminal intracellular domains interferes with the recognition of Gpm6a by the function-blocking antibody directed against the extracellular part of Gpm6a. Expression levels of both truncation mutants were not affected but we observed decrease in the amount of both truncated proteins on cell surface suggesting that the incapacity of the Gpm6a lacking C-terminus to induce filopodium formation is not due to the lower amount of Gpm6a on cell surface. Following colocalization assays shows that deletion of the C- but not the N-terminus diminishes the association of Gpm6a with clathrin implying involvement of clathrin-mediated trafficking events. Next, using comprehensive alanine scanning mutagenesis of the C-terminus we identify K250, K255, and E258 as the key residues for the formation of filopodia by Gpm6a. Substitution of these charged residues with alanine also diminishes the amount of Gpm6a on cell surface and in case of K255 and E258 leads to the lower amount of total expressed protein. Subsequent bioinformatic analysis of Gpm6a amino acid sequence reveals that highly conserved and functional residues cluster preferentially within the C- and not within the N-terminus and that K250, K255, and E258 are predicted as part of sorting signals of transmembrane proteins. Altogether, our results provide evidence that filopodium outgrowth induced by Gpm6a requires functionally critical residues within the C-terminal cytoplasmic tail.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
البروتين السكري الغشائي العصبي M6a (Gpm6a) هو بروتين يحتوي على أربع مناطق عبر الغشاء والنهايات N - و C التي تواجه الخلية. وهو يعمل في عمليات التطور العصبي، ونمو الخلايا العصبية، وتشكيل الأقدام الخيطية، والأشواك، والمشبك العصبي. الآليات الجزيئية التي يعمل بها Gpm6a في هذه العمليات ليست مفهومة تمامًا. قادنا التشابه الهيكلي بين Gpm6a و tetraspanins إلى افتراض أنه، على غرار tetraspanins، تعمل ذيول السيتوبلازما كوصلات مع البروتينات الهيكلية الخلوية و/أو بروتينات الإشارة. هنا، نوضح أن الطرف C - ولكن ليس الطرف N من Gpm6a مطلوب لتشكيل Filopodia بواسطة Gpm6a في الخلايا العصبية المستزرعة من قرن آمون الفئران وفي خلايا الورم الأرومي العصبي N2a. يُظهر المزيد من التحليل المجهري للتألق المناعي وقياس التدفق الخلوي أن حذف المجالات داخل الخلايا N - ولا الطرفية C يتداخل مع التعرف على Gpm6a بواسطة الجسم المضاد لحجب الوظائف الموجه ضد الجزء خارج الخلية من Gpm6a. لم تتأثر مستويات التعبير لكل من طفرات الاقتطاع لكننا لاحظنا انخفاضًا في كمية كل من البروتينات المقتطعة على سطح الخلية مما يشير إلى أن عدم قدرة Gpm6a التي تفتقر إلى الطرف C للحث على تكوين الخيطيات لا يرجع إلى انخفاض كمية Gpm6a على سطح الخلية. بعد فحوصات التوطين يظهر أن حذف C - ولكن ليس الطرف N يقلل من ارتباط Gpm6a مع clathrin مما يعني تورط أحداث الاتجار بوساطة clathrin. بعد ذلك، باستخدام طفرات مسح الألانين الشاملة للطرف C، نحدد K250 و K255 و E258 كمخلفات رئيسية لتشكيل الأقدام الخيطية بواسطة Gpm6a. كما أن استبدال هذه البقايا المشحونة بالألانين يقلل من كمية Gpm6a على سطح الخلية وفي حالة K255 و E258 يؤدي إلى كمية أقل من إجمالي البروتين المعبر عنه. يكشف التحليل المعلوماتي الحيوي اللاحق لتسلسل الأحماض الأمينية Gpm6a أن البقايا المحفوظة للغاية والوظيفية تتجمع بشكل تفضيلي داخل C - وليس داخل الطرف N وأن K250 و K255 و E258 متوقعة كجزء من فرز إشارات البروتينات عبر الغشاء. إجمالاً، تقدم نتائجنا دليلًا على أن نمو القاع الناجم عن Gpm6a يتطلب بقايا حرجة وظيفيًا داخل الذيل السيتوبلازمي الطرفي C.Translated Description (French)
La glycoprotéine membranaire neuronale M6a (Gpm6a) est une protéine avec quatre régions transmembranaires et les extrémités N- et C faisant face au cytosol. Il fonctionne dans les processus de développement neuronal, de croissance des neurites et de formation de filopodes, d'épines et de synapses. Les mécanismes moléculaires par lesquels Gpm6a agit dans ces processus ne sont pas entièrement compris. Les similitudes structurelles de Gpm6a avec les tétraspanines nous ont amenés à émettre l'hypothèse que, de la même manière que les tétraspanines, les queues cytoplasmiques fonctionnent comme des connexions avec les protéines cytosquelettiques et/ou de signalisation. Ici, nous démontrons que l'extrémité cytosolique C- mais pas l'extrémité N-terminale de Gpm6a est nécessaire à la formation de filopodes par Gpm6a dans les neurones cultivés de l'hippocampe de rat et dans les cellules de neuroblastome N2a. D'autres analyses de microcopie par immunofluorescence et de cytométrie de flux montrent que la délétion des domaines intracellulaires N- et C-terminaux n'interfère pas avec la reconnaissance de Gpm6a par l'anticorps bloquant la fonction dirigé contre la partie extracellulaire de Gpm6a. Les niveaux d'expression des deux mutants de troncature n'ont pas été affectés, mais nous avons observé une diminution de la quantité des deux protéines tronquées à la surface des cellules, ce qui suggère que l'incapacité du Gpm6a dépourvu d'extrémité C-terminale à induire la formation de filopodes n'est pas due à la quantité plus faible de Gpm6a à la surface des cellules. Les essais de colocalisation suivants montrent que la délétion de l'extrémité C- mais pas de l'extrémité N-terminale diminue l'association de Gpm6a avec la clathrine, ce qui implique l'implication d'événements de trafic médiés par la clathrine. Ensuite, en utilisant la mutagenèse complète par balayage de l'alanine de l'extrémité C-terminale, nous identifions K250, K255 et E258 comme les résidus clés pour la formation de filopodes par Gpm6a. La substitution de ces résidus chargés par l'alanine diminue également la quantité de Gpm6a à la surface des cellules et, dans le cas des protéines K255 et E258, conduit à une quantité plus faible de protéines totales exprimées. L'analyse bioinformatique subséquente de la séquence d'acides aminés de Gpm6a révèle que les résidus hautement conservés et fonctionnels se regroupent de préférence dans le C- et non dans le N-terminal et que K250, K255 et E258 sont prédits dans le cadre des signaux de tri des protéines transmembranaires. Au total, nos résultats fournissent la preuve que l'excroissance de filopodium induite par Gpm6a nécessite des résidus fonctionnellement critiques dans la queue cytoplasmique C-terminale.Translated Description (Spanish)
La glicoproteína de membrana neuronal M6a (Gpm6a) es una proteína con cuatro regiones transmembrana y los extremos N y C orientados hacia el citosol. Funciona en procesos de desarrollo neuronal, crecimiento de neuritas y formación de filopodios, espinas y sinapsis. Los mecanismos moleculares por los cuales Gpm6a actúa en estos procesos no se comprenden completamente. Las similitudes estructurales de Gpm6a con las tetraspaninas nos llevaron a plantear la hipótesis de que, al igual que las tetraspaninas, las colas citoplasmáticas funcionan como conexiones con las proteínas citoesqueléticas y/o de señalización. Aquí, demostramos que se requiere el extremo citosólico C- pero no el extremo N-terminal de Gpm6a para la formación de filopodios por Gpm6a en neuronas cultivadas de hipocampo de rata y en células de neuroblastoma N2a. La microcopia de inmunofluorescencia adicional y el análisis de citometría de flujo muestran que la eliminación de los dominios intracelulares N- ni C-terminales no interfiere con el reconocimiento de Gpm6a por el anticuerpo bloqueador de la función dirigido contra la parte extracelular de Gpm6a. Los niveles de expresión de ambos mutantes de truncamiento no se vieron afectados, pero observamos una disminución en la cantidad de ambas proteínas truncadas en la superficie celular, lo que sugiere que la incapacidad del Gpm6a que carece del extremo C para inducir la formación de filopodio no se debe a la menor cantidad de Gpm6a en la superficie celular. Los siguientes ensayos de colocalización muestran que la eliminación del extremo C, pero no del extremo N, disminuye la asociación de Gpm6a con clatrina, lo que implica la participación de eventos de tráfico mediados por clatrina. A continuación, utilizando la mutagénesis de barrido de alanina integral del extremo C-terminal, identificamos K250, K255 y E258 como los residuos clave para la formación de filopodios por Gpm6a. La sustitución de estos residuos cargados con alanina también disminuye la cantidad de Gpm6a en la superficie celular y en el caso de K255 y E258 conduce a la menor cantidad de proteína expresada total. El análisis bioinformático posterior de la secuencia de aminoácidos de Gpm6a revela que los residuos altamente conservados y funcionales se agrupan preferentemente dentro del extremo C y no dentro del extremo N y que K250, K255 y E258 se predicen como parte de las señales de clasificación de las proteínas transmembrana. En conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia de que el crecimiento de filopodio inducido por Gpm6a requiere residuos funcionalmente críticos dentro de la cola citoplasmática C-terminal.Files
pdf.pdf
Files
(6.1 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:c501a83194ae94f6d9ef7df3eb94bcb8
|
6.1 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تحدد طفرة مسح الألانين لنهاية C - Terminal Cytosolic End of Gpm6a المخلفات الرئيسية الضرورية لتشكيل Filopodia
- Translated title (French)
- La mutagénèse par balayage à l'alanine de l'extrémité cytosolique C-terminale de Gpm6a identifie les principaux résidus essentiels à la formation de filopodia
- Translated title (Spanish)
- La mutagénesis de escaneo de alanina del extremo citosólico C-terminal de Gpm6a identifica residuos clave esenciales para la formación de filopodios
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2889180664
- DOI
- 10.3389/fnmol.2018.00314
References
- https://openalex.org/W144036770
- https://openalex.org/W1552956347
- https://openalex.org/W1656231611
- https://openalex.org/W1925877006
- https://openalex.org/W1965309626
- https://openalex.org/W1985875533
- https://openalex.org/W1994640931
- https://openalex.org/W1996882964
- https://openalex.org/W1998459062
- https://openalex.org/W1999252644
- https://openalex.org/W1999476423
- https://openalex.org/W2005463034
- https://openalex.org/W2006458047
- https://openalex.org/W2013094398
- https://openalex.org/W2013754064
- https://openalex.org/W2014084841
- https://openalex.org/W2016072991
- https://openalex.org/W2023692012
- https://openalex.org/W2026489741
- https://openalex.org/W2027436298
- https://openalex.org/W2031489662
- https://openalex.org/W2031621183
- https://openalex.org/W2035584486
- https://openalex.org/W2036012822
- https://openalex.org/W2036959324
- https://openalex.org/W2038634187
- https://openalex.org/W2038705255
- https://openalex.org/W2045035263
- https://openalex.org/W2052168193
- https://openalex.org/W2055550014
- https://openalex.org/W2057682817
- https://openalex.org/W2058750858
- https://openalex.org/W2063186096
- https://openalex.org/W2065755128
- https://openalex.org/W2071393027
- https://openalex.org/W2073365737
- https://openalex.org/W2077776663
- https://openalex.org/W2087728854
- https://openalex.org/W2091713244
- https://openalex.org/W2094369068
- https://openalex.org/W2100420577
- https://openalex.org/W2100937870
- https://openalex.org/W2109476749
- https://openalex.org/W2113437821
- https://openalex.org/W2114886480
- https://openalex.org/W2117788130
- https://openalex.org/W2118424111
- https://openalex.org/W2126138447
- https://openalex.org/W2133152055
- https://openalex.org/W2135004571
- https://openalex.org/W2137576652
- https://openalex.org/W2146971404
- https://openalex.org/W2148351021
- https://openalex.org/W2152519008
- https://openalex.org/W2153909879
- https://openalex.org/W2166987747
- https://openalex.org/W2168621448
- https://openalex.org/W2171779714
- https://openalex.org/W2326956930
- https://openalex.org/W2376573086
- https://openalex.org/W2593429864
- https://openalex.org/W2754331242
- https://openalex.org/W2766178360
- https://openalex.org/W2770941605
- https://openalex.org/W2791380365