Molecular Basis of the Differential Sensitivity of Nematode and Mammalian Muscle to the Anthelmintic Agent Levamisole
- 1. Centro Científico Tecnológico - Bahía Blanca
Description
Levamisole is an anthelmintic agent that exerts its therapeutic effect by acting as a full agonist of the nicotinic receptor (AChR) of nematode muscle. Its action at the mammalian muscle AChR has not been elucidated to date despite its wide use as an anthelmintic in humans and cattle. By single channel and macroscopic current recordings, we investigated the interaction of levamisole with the mammalian muscle AChR. Levamisole activates mammalian AChRs. However, single channel openings are briefer than those activated by acetylcholine (ACh) and do not appear in clusters at high concentrations. The peak current induced by levamisole is about 3% that activated by ACh. Thus, the anthelmintic acts as a weak agonist of the mammalian AChR. Levamisole also produces open channel blockade of the AChR. The apparent affinity for block (190 μm at –70 mV) is similar to that of the nematode AChR, suggesting that differences in channel activation kinetics govern the different sensitivity of nematode and mammalian muscle to anthelmintics. To identify the structural basis of this different sensitivity, we performed mutagenesis targeting residues in the α subunit that differ between vertebrates and nematodes. The replacement of the conserved αGly-153 with the homologous glutamic acid of nematode AChR significantly increases the efficacy of levamisole to activate channels. Channel activity takes place in clusters having two different kinetic modes. The kinetics of the high open probability mode are almost identical when the agonist is ACh or levamisole. It is concluded that αGly-153 is involved in the low efficacy of levamisole to activate mammalian muscle AChRs. Levamisole is an anthelmintic agent that exerts its therapeutic effect by acting as a full agonist of the nicotinic receptor (AChR) of nematode muscle. Its action at the mammalian muscle AChR has not been elucidated to date despite its wide use as an anthelmintic in humans and cattle. By single channel and macroscopic current recordings, we investigated the interaction of levamisole with the mammalian muscle AChR. Levamisole activates mammalian AChRs. However, single channel openings are briefer than those activated by acetylcholine (ACh) and do not appear in clusters at high concentrations. The peak current induced by levamisole is about 3% that activated by ACh. Thus, the anthelmintic acts as a weak agonist of the mammalian AChR. Levamisole also produces open channel blockade of the AChR. The apparent affinity for block (190 μm at –70 mV) is similar to that of the nematode AChR, suggesting that differences in channel activation kinetics govern the different sensitivity of nematode and mammalian muscle to anthelmintics. To identify the structural basis of this different sensitivity, we performed mutagenesis targeting residues in the α subunit that differ between vertebrates and nematodes. The replacement of the conserved αGly-153 with the homologous glutamic acid of nematode AChR significantly increases the efficacy of levamisole to activate channels. Channel activity takes place in clusters having two different kinetic modes. The kinetics of the high open probability mode are almost identical when the agonist is ACh or levamisole. It is concluded that αGly-153 is involved in the low efficacy of levamisole to activate mammalian muscle AChRs. At the neuromuscular junction, acetylcholine (ACh) 1The abbreviations used are: AChR, nicotinic acetylcholine receptor; ACh, acetylcholine; Popen, channel open probability; HEK cells, human embryonic kidney cells. mediates fast neurotransmission by activating nicotinic receptors (AChRs). AChRs in nematode muscle are targets for anthelmintic chemotherapy. Levamisole and pyrantel are two widely used anthelmintic drugs. By binding to the AChR they lead to a depolarization of the somatic muscle of nematodes. The efficacy of these drugs is based on their ability to act as full agonists of AChRs in nematodes (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). Contractility and membrane potential measurements have shown that the nematode axial muscle is 10–100 times more sensitive to the acute action of pyrantel and levamisole than the rat muscle (2Atchison W.D. Geary T.G. Manning B. VandeWaa E.A. Thompson D.P. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992; 112: 133-143Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar). The molecular bases of this selectivity have not been yet elucidated. The kinetics of activation of nematode AChRs by levamisole has been studied in several preparations from parasite muscle (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar, 3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993; 108: 170-178Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar), but its action on mammalian muscle AChRs has not been described to date. The effects of levamisole on human neuronal α3β2 and α3β4 AChRs have been studied recently (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003; 471: 9-20Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar) with the voltage clamp method. It was shown that levamisole behaves as a weak partial agonist, an allosteric modulator, and an open channel blocker of neuronal AChRs (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003; 471: 9-20Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). ACh is responsible for neuromuscular transmission in nematodes (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). In Caenorhabditis elegans muscle, levamisole-activated AChRs are composed of the unc-38 subunit, which encodes an α subunit, and lev-1 and unc-29, which encode non-α subunits (5Fleming J.T. Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997; 17: 5843-5857Crossref PubMed Google Scholar). Expression studies in Xenopus oocytes have shown that both unc-38 and unc-29 subunits are necessary for AChR function (5Fleming J.T. Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997; 17: 5843-5857Crossref PubMed Google Scholar). Both subunits are required for the expression of levamisole-sensitive receptors in body wall muscles of these nematodes (6Richmond J.E. Jorgensen E.M. Nat. Neurosci. 1999; 2: 791-797Crossref PubMed Scopus (356) Google Scholar). Other nematode α subunits have been cloned from the parasitic nematodes Trichostrongylus colubriformis (7Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Li Q. Gene (Amst.). 1996; 182: 97-100Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar), Haemonchus conturtus (8Hoekstra R. Visser A. Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Roos M.H. Mol. Biochem. Parasitol. 1997; 84: 79-187Crossref Scopus (46) Google Scholar), and Ascaris suum (9Le Novère N. Changeux J.P. Nucleic Acid Res. 1999; 27: 340-342Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar), showing a 91.6, 91, and 76% similarity with unc-38, respectively. The main structural features of the AChR subunits are strikingly conserved in phylogeny from higher organisms to the nematode. However, residues differentially conserved between mammalian and nematode AChRs may lead to a differential pharmacological action of anthelmintics at AChRs. In this study, we explore for the first time the interaction of levamisole with mammalian muscle AChRs at the single channel and macroscopic current levels. Our results reveal that levamisole shows an extremely low efficacy for channel activation. At high levamisole concentrations, channel blockade also contributes to maintain a low probability of channel opening. In contrast, levamisole has been shown to act as a potent agonist of different nematode muscle AChRs (3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993; 108: 170-178Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 10Lewis J.A. Wu C.H. Levine J.H. Berg H. Neuroscience. 1980; 5: 967-989Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar, 11Harrow I.D. Gration K.F. Pestic. Sci. 1985; 16: 662-672Crossref Scopus (99) Google Scholar, 12Martin R.J. Pennington A.J. Duittoz A.H. Robertson S. Kusel J.R. Parasitology. 1991; 102: 41-58Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). Thus, this anthelmintic compound therapeutically exploits differences by selectively activating the AChR of the parasite and not that of the host. To identify residues involved in this different selectivity, we combined site-directed mutagenesis at residues differentially conserved between muscle α subunits from nematodes and vertebrates, and we evaluated the changes in levamisole activation. Our results reveal that the glutamic acid at position 153, which is highly conserved in all nematode α subunits cloned to date, may be involved in the potent activation of nematode AChRs by levamisole. The elucidation of the molecular basis of anthelmintic activation of AChRs will greatly contribute to the development of more selective therapies against parasites and to the understanding of how parasites develop resistance to the anthelmintics. In addition, it pinpoints determinants of function. Site-directed Mutagenesis and Expression of AChR—HEK293 cells were transfected with mouse α (wild-type or mutant), β, δ, and ϵ cDNAs using calcium phosphate precipitation at a subunit ratio of 2:1:1:1 for α:β:δ:ϵ, respectively, mainly as described previously (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo A.M. Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998; 54: 146-153Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). A plasmid encoding green fluorescent protein (pGreen lantern) was also included for recordings to allow identification of transfected cells under fluorescence optics. Mutant subunits were constructed using the QuikChange™ site-directed mutagenesis kit (Stratagene). Restriction mapping and DNA sequencing confirmed all constructs. Cells were used for patch clamp recordings 48 h after transfection. Patch Clamp Recordings and Kinetic Analysis—Recordings were obtained in the cell-attached configuration (15Hamill O.P. Marty A. Neher E. Sakmann B. Sigworth F.J. Pfluegers Arch. 1981; 391: 85-100Crossref PubMed Scopus (15149) Google Scholar) at 20 °C (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar). The bath and pipette solutions contained 142 mm KCl, 5.4 mm NaCl, 1.8 mm CaCl2, 1.7 mm MgCl2, and 10 mm HEPES (pH 7.4). Acetylcholine (ACh), levamisole (Sigma), or both drugs were added to the pipette solution. Single channel currents were recorded using an Axopatch 200 B patch clamp amplifier (Axon Instruments, Inc., CA), digitized at 5-μs intervals with the PCI-611E interface (National Instruments, Austin, TX), recorded to the hard disk of a computer using the program Acquire (Bruxton Corporation, Seattle, WA), and detected by the half-amplitude threshold criterion using the program TAC 4.0.10 (Bruxton Corporation, Seattle, WA) at a final bandwidth of 10 kHz. Open and closed time histograms were plotted using a logarithmic abscissa and a square root ordinate and fitted to the sum of exponentials by maximum likelihood using the program TACFit (Bruxton Corp., Seattle, WA). Clusters were identified as a series of closely spaced events preceded and followed by closed intervals longer than a specified duration (tcrit); this duration was taken as the point of intersection of the predominant closed time component and the succeeding one in the closed time histogram. Clusters showing double openings were discarded. For each recording, clusters were selected on the basis of their distribution of open probability (Popen), mean open duration, and mean closed duration (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar). Popen distributions of the αG153E mutant AChR show two clear components, which were defined as high Popen (HPopen) and low Popen (LPopen) mode. Clusters of each mode were first selected to allow a separate kinetic analysis for each mode. For the analysis, we only used clusters that showed only one gating mode. For the high Popen mode activated by ACh and levamisole, the kinetic analysis was restricted to clusters, each reflecting the activity of a single AChR (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar). The resulting open and closed intervals from the selected clusters were analyzed according to kinetic schemes using an interval-based full-likelihood algorithm (www.qub.buffalo.edu) (QuB suite, State University of New York, Buffalo). The dead time was typically 30 μs. Probability density functions of open and closed durations were calculated from the fitted rate constants and instrumentation dead time and superimposed on the experimental dwell time histogram as described by Qin et al. (19Qin F. Auerbach A. Sachs F. Biophys. J. 1996; 70: 264-280Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (372) Google Scholar). Calculated rates were accepted only if the resulting probability density functions correctly fitted the experimental open and closed duration histograms. The other approach was applied to the low Popen gating mode of the αG153E AChR and to wild-type AChRs activated by levamisole, in which less clear or no clusters were observed. We analyzed the behavior of bursts of single channel activity elicited by low agonist concentrations, where no clusters can be seen and block is insignificant, on the basis of the classical activation Scheme 1, where two agonists (A) bind to the receptor (R) in the resting state with association rates k+1 and k+2 and dissociate with rates k–1 and k–2. AChRs occupied by two agonist molecules open with rate β and close with rate α. Bursts at low agonist concentrations contain information about the open state and the immediately adjacent closed state (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). Therefore, estimates of β, α, and k–2 can be obtained from the mean duration of the briefer component of the closed time histogram (τc), its relative area (Aτc), and the mean burst duration (τb) as follows: τc = 1/(β + k–2); Aτc = β/(β + k–2); τb = (1 + β/k–2) (1/α). Macroscopic Current Recordings—For outside-out patch recordings, the pipette solution contained 140 mm KCl, 5 mm EGTA, 5 mm MgCl2, and 10 mm HEPES (pH 7.3). Extracellular solution contained 150 mm NaCl, 5.6 mm KCl, 1.8 mm CaCl2, 1 mm MgCl2, and 10 mm HEPES (pH 7.3). The patch was excised in this configuration and moved into position at the outflow of a perfusion system as described before (20Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001; 60: 235-243Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 21Gumilar F. Arias H.R. Spitzmaul G. Bouzat C. Neuropharmacol. 2003; 45: 964-976Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). The perfusion system allows for a rapid (0.1–1 ms) exchange of the solution bathing the patch. A series of applications of extracellular solution containing ACh, levamisole, or both drugs were applied to the patch during 150 ms. Macroscopic currents were filtered at 5 kHz, digitized at 20 kHz, and stored on the hard disk. Data analysis was performed using the IgorPro software (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR). The ensemble mean current was calculated for 5–10 individual current traces. Mean currents were usually fitted by a single exponential function: I(t) = I0 exp(–t/τd) + I∞ where I0 and I∞ are the peak and the steady state current values, respectively, and τd is the decay time constant that measures the current decay due to desensitization. Current records were aligned with each other at the point where the current reached 50% of its maximum level. Single Channel Currents Activated by Levamisole—Levamisole is a full agonist of the nematode muscle AChR (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). In the present study, we evaluated if this anthelmintic drug also acts on mammalian muscle AChRs. To this end, we first recorded single channels from cells expressing adult muscle AChRs (Fig. 1). As shown in this figure, levamisole is capable of activating mammalian AChRs. However, channel openings are significantly briefer than those activated by the endogenous neurotransmitter ACh. Open time distributions of 1 μm levamisole-activated AChRs can be well fitted by a main component of 220 ± 20 μs (relative area >0.7) (Fig. 1). The duration of the main open component is 4-fold briefer than that observed at 1 μm ACh (860 ± 80 μs, Fig. 1) (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo A.M. Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998; 54: 146-153Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). Increasing levamisole concentration from 1 to 300 μm does not produce the typical clustering observed with full agonists, such as ACh. At ACh concentrations higher than 10 μm, wild-type AChRs open in clusters of well defined activation episodes (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) (Fig. 1). Each activation episode begins with the transition of a single receptor from the desensitized to the activable state and terminates by returning to the desensitized state. At 300 μm ACh, the probability of channel opening within a cluster is ∼1 (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar; Fig. 1). In contrast, when AChRs are activated by levamisole, even at concentrations as high as 300 μm, clusters are not observed (Fig. 1). These results suggest that levamisole opens mammalian AChRs with greater latency and closes them faster than ACh. Increasing levamisole concentration from 1 to 300 μm leads to a significant reduction of open durations. Open time histograms of AChRs activated by 300 μm levamisole can be fitted by a single exponential with a mean open time of 80 ± 9 μs (Fig. 1). Such a concentration-dependent decrease in the mean open time indicates that in addition to its capability of activating mammalian AChRs, levamisole may act as an open channel blocker (see below). Macroscopic Currents Activated by Levamisole—To evaluate the efficacy of levamisole in activating mammalian AChRs, we recorded macroscopic currents from outside-out patches rapidly perfused with levamisole. Fig. 2 shows ensemble currents obtained from a single outside-out patch exposed to brief applications of 100 μm ACh (control) and 100 μm levamisole. In control data, the current reaches the peak after 0.1–1 ms and then decays with a time constant (τd) of about 20–30 ms due to desensitization (Fig. 2) (20Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001; 60: 235-243Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). The peak current is only about 3% when the same patch is exposed to 100 μm levamisole. Moreover, in many patches only single channels were observed after perfusion with levamisole. These results confirm the low efficacy of the drug to activate mammalian AChRs. Given that the single channel recording experiments suggest that levamisole may also block AChRs (Fig. 1), we studied its action as a channel blocker in the absence and presence of ACh. Increasing levamisole concentration systematically displaces to briefer durations the open time distributions of AChR channels activated either by 1 μm ACh (Fig. 3) or by levamisole (Fig. 1). We used the classical linear blocking model to describe the action of levamisole as an open channel blocker as shown in Scheme 2, where C indicates closed, O indicates open, and OB indicates blocked states. In agreement with Scheme 2, a linear relationship between the reciprocal of the mean open time and levamisole concentration ([B]) is observed (Fig. 4a). The calculated value for the forward rate constant of the blocking reaction (k+b in Scheme 2), given by the slope of the curve, is 30 × 106 and 25 × 106m–1 s–1 for ACh- or levamisole-activated channels. Thus, AChRs activated by either ACh or levamisole are blocked by levamisole at a similar rate. The apparent closing rate, calculated from the intercept with the y axis, is 5600 s–1 for levamisole-activated AChRs and 1600 s–1 for ACh-activated channels. This value agrees with the closing rate of ACh-activated channels calculated by kinetic analysis (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar).Fig. 4Characterization of levamisole blockade. a, AChR channels were recorded in the absence (•) and presence (○) of 1 μm ACh plus levamisole at different final concentrations. The mean open times were obtained from the corresponding open time histograms. The data are fitted by the equation 1/mean open time = α + k+b [levamisole], where k+b is the association rate of levamisole for channel block, and α is the apparent channel closing rate. Data are shown as mean ± S.D. of 3–5 patches. b, AChR currents were recorded in the presence of 1 μm ACh plus levamisole. The mean blocked time (•) and its relative area (○) were obtained from the corresponding closed time histograms. Data are shown as mean ± S.D. of 3–5 different recordings for each condition. Membrane potential, –70 mV. c, relationship between the mean blocked time and membrane potential. Levamisole concentration, 50 μm. Data are shown as mean ± S.D. of 3–5 patches. d, rapid perfusion currents activated by 1 mm ACh (control) alone and together with 100 μm levamisole (+ levamisole). Currents were recorded at –70 mV (downward currents) and +70 mV (upward currents). Each current represents the average of 5–10 records.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) To analyze the blockade by levamisole, we studied the closed time distributions of AChRs activated by 1 μm ACh in the presence of levamisole. In its absence, closed time histograms corresponding to 1 μm ACh-activated channels show a main component whose duration is dependent on the number of channels in the patch (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) (Fig. 3). The presence of levamisole significantly changes the closed time distributions of ACh-activated channels, and a new closed component of about 175 μs is systematically observed (Fig. 3). The duration of this component does not change with levamisole concentration, but its area increases as a function of its concentration (Fig. 4b). It is therefore possible to assume that this closed component corresponds to the blockade by levamisole of the ACh-activated channels (1/k–b in Scheme 2). From the duration of this closed component (1/k–b) a value of 5700 s–1 is obtained for k–b. Thus, the apparent dissociation constant for the blocking process, KB = k–b/k+b, is 190 μm at a membrane potential of –70 mV. At levamisole concentrations higher than 100 μm, the blocked area does not increase as a function of concentration. The values for the closed components and relative areas are 175 ± 12 μs and 0.32 ± 0.03, and 220 ± 15, and 0.33 ± 0.08 μs for 100 and 300 μm levamisole, respectively. Therefore, at higher concentrations the channel block mechanism deviates from Scheme 2. The duration of the blocked periods increases with higher negative membrane potentials, indicating that the unblocking process is voltage-dependent (Fig. 4c). The voltage dependence of the effect is confirmed by outside-out patch recordings (Fig. 4d). At positive membrane potentials, 100 μm levamisole does not affect the decay constant of currents elicited by 1 mm ACh, and the data can be fitted by a single exponential decay similar to the control (22.5 ms). In contrast, at –70 mV, an initial fast decay precedes desensitization. This fast component (about 0.5 ms) is due to open channel blockade. The slow decay time constant, which corresponds to desensitization, is 19.4 ± 1.8 ms. The peak current is not affected, suggesting that at the ratio of concentrations that are used, levamisole cannot compete with ACh for channel activation. In short, the characterization of the blockade indicates that levamisole acts as a typical open channel blocker at concentrations below 100 μm. Sequence comparison reveals key residues that are differentially conserved between mammalian and nematode muscle α subunits (Fig. 5). To identify if these residues are involved in the differential behavior of anthelmintic drugs at parasite and mammalian muscle, we replaced them by the equivalent residues in nematodes, cotransfected cells with the mutant α and wild-type non-α subunits, and we evaluated channel activity elicited by levamisole. The efficacy of levamisole to activate mammalian AChRs is greatly increased when the residue αGly-153 is replaced by a glutamic acid. As shown in Fig. 6, channel activity appears now in easily recognizable clusters at 50 μm levamisole. In contrast, no changes are observed in the activation by levamisole (1–100 μm) of AChRs carrying either the mutations αD152S, αS154N, or the insertion of a proline after αTyr-190 (α191insP).Fig. 6Activation of mutant AChRs by levamisole. Channels activated by 50 μm levamisole were recorded from HEK cells expressing AChRs containing wild-type and the mutant αD152S, αG153E, αS154N, and α191insP subunits. Left, currents are displayed at a bandwidth of 9 kHz with channel openings as upward deflections. Membrane potential, –70 mV. Right, closed time histograms of AChRs carrying the specified mutant subunit. The data are representative of 4–6 recordings for each condition.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) Clusters of αG153E AChR can be identified at concentrations higher than 10 μm. The clustering of opening events is accompanied by important changes in the closed time histograms. The main component of the closed time distributions, which corresponds to closings within clusters, is displaced to briefer durations as a function of levamisole concentration (Fig. 7). To uncover the mechanistic consequences of the presence of a glutamic acid at α153, we recorded channels activated by a range of levamisole concentrations (0.1 nm to 300 μm) and analyzed the activity of single channel openings in clusters. In parallel, we compared the kinetics of activation by the full agonist ACh. When examined in detail, it can be observed that clusters of αG153E activated by either ACh or levamisole are not homogeneous, indicating that this mutant receptor activates in distinct kinetic modes (Fig. 8). The distribution of Popen values showed two different components (see "Experimental Procedures"). We therefore classified the clusters as belonging to two main gating modes: an HPopen and an LPopen mode. At all agonist concentrations, the HPopen mode consisted of openings that were significantly longer and closings within clusters that were briefer than those of the LPopen mode (Table I). Based on the Popen distributions, we selected the clusters corresponding to each mode and analyzed them as a function of agonist concentration (Table I and Fig. 8).Table IChannel properties of αG153E mutant AChRs activated by ACh or levamisoleKinetic modeAChLevamisoleτoτcPopenμmmsHPopen0.00011.560.10.930.011.71 ± 0.240.08 ± 0.0070.98 ± 0.0090.11.78 ± 0.050.07 ± 0.0050.96 ± 0.002100.380.320.52500.260.320.451000.210.260.460.012.40 ± 0.200.05 ± 0.0020.98 ± 0.00113.20 ± 0.760.05 ± 0.0080.98 ± 0.002104.30 ± 0.670.05 ± 0.0030.98 ± 0.002502.70 ± 0.660.05 ± 0.0140.97 ± 0.0091002.80 ± 0.570.04 ± 0.0080.97 ± 0.005LPopen0.010.43 ± 0.07NDND10.31 ± 0.10NDND100.23 ± 0.0717.00 ± 6.500.019 ± 0.008500.19 ± 0.0210.60 ± 1.900.027 ± 0.0021000.16 ± 0.025.08 ± 0.800.037 ± 0.0043000.08 ± 0.0053.50 ± 1.000.027 ± 0.00510.9 ± 0.1NDND101.1 ± 0.31.51 ± 0.150.42 ± 0.13501.1 ± 0.20.32 ± 0.050.83 ± 0.051001.2 ± 0.10.25 ± 0.020.88 ± 0.02 Open table in a new tab High Popen Clusters—At very low concentrations of ACh or levamisole (0.1 nm to1 μm), only clusters corresponding to the high Popen gating mode can be observed (Fig. 8). The rest of the openings appear as isolated events. The Popen calculated for these clusters is about 1 at 1 nm of either agonist. Most interestingly, there are no significant differences in the properties between ACh- or levamisole-activated clusters (Fig. 8 and Table I). Therefore, at low agonist concentrations, levamisole activation of the αG153E AChR seems to be kinetically indistinguishable from ACh activation. Clusters of the HPopen mode are also observed at higher concentrations of both agonists. However, the mean channel duration as well as the Popen decrease at higher concentrations of levamisole due to channel blockade (Table I). Low Popen Clusters—As the agonist concentr
Translated Descriptions
Translated Description (Arabic)
الليفاميزول هو عامل مضاد للديدان يمارس تأثيره العلاجي من خلال العمل كناهض كامل لمستقبل النيكوتين (AChR) لعضلة الديدان الخيطية. لم يتم توضيح تأثيره على عضلة الثدييات AChR حتى الآن على الرغم من استخدامه على نطاق واسع كمضاد للديدان في البشر والماشية. من خلال قناة واحدة وتسجيلات التيار العياني، قمنا بالتحقيق في تفاعل الليفاميزول مع عضلة الثدييات AChR. ينشط الليفاميزول AChRs للثدييات. ومع ذلك، فإن فتحات القناة الواحدة أكثر إيجازًا من تلك التي ينشطها الأسيتيل كولين (ACh) ولا تظهر في مجموعات بتركيزات عالية. يبلغ تيار الذروة الناجم عن الليفاميزول حوالي 3 ٪ والذي يتم تنشيطه بواسطة ACh. وبالتالي، يعمل طارد الديدان كناهض ضعيف لـ AChR للثدييات. ينتج ليفاميزول أيضًا حصارًا مفتوح القناة لـ AChR. يشبه التقارب الظاهري للكتلة (190 ميكرومتر عند –70 مللي فولط) تقارب الديدان الخيطية AChR، مما يشير إلى أن الاختلافات في حركية تنشيط القناة تتحكم في الحساسية المختلفة للديدان الخيطية والعضلات الثديية لمضادات الديدان. لتحديد الأساس الهيكلي لهذه الحساسية المختلفة، أجرينا طفرات تستهدف البقايا في الوحدة الفرعية ألفا التي تختلف بين الفقاريات والديدان الخيطية. إن استبدال αGly -153 المحفوظ بحمض الجلوتاميك المتماثل للديدان الخيطية AChR يزيد بشكل كبير من فعالية الليفاميزول لتنشيط القنوات. يحدث نشاط القناة في مجموعات لها وضعان حركيان مختلفان. تكون حركية وضع الاحتمال المفتوح العالي متطابقة تقريبًا عندما يكون الناهض ACh أو levamisole. تم استنتاج أن αGly -153 يشارك في انخفاض فعالية الليفاميزول لتنشيط AChRs لعضلات الثدييات. الليفاميزول هو عامل مضاد للديدان يمارس تأثيره العلاجي من خلال العمل كناهض كامل لمستقبل النيكوتين (AChR) لعضلة الديدان الخيطية. لم يتم توضيح تأثيره على عضلة الثدييات AChR حتى الآن على الرغم من استخدامه على نطاق واسع كمضاد للديدان في البشر والماشية. من خلال قناة واحدة وتسجيلات التيار العياني، قمنا بالتحقيق في تفاعل الليفاميزول مع عضلة الثدييات AChR. ينشط الليفاميزول AChRs للثدييات. ومع ذلك، فإن فتحات القناة الواحدة أكثر إيجازًا من تلك التي ينشطها الأسيتيل كولين (ACh) ولا تظهر في مجموعات بتركيزات عالية. يبلغ تيار الذروة الناجم عن الليفاميزول حوالي 3 ٪ والذي يتم تنشيطه بواسطة ACh. وبالتالي، يعمل طارد الديدان كناهض ضعيف لـ AChR للثدييات. ينتج ليفاميزول أيضًا حصارًا مفتوح القناة لـ AChR. يشبه التقارب الظاهري للكتلة (190 ميكرومتر عند –70 مللي فولط) تقارب الديدان الخيطية AChR، مما يشير إلى أن الاختلافات في حركية تنشيط القناة تتحكم في الحساسية المختلفة للديدان الخيطية والعضلات الثديية لمضادات الديدان. لتحديد الأساس الهيكلي لهذه الحساسية المختلفة، أجرينا طفرات تستهدف البقايا في الوحدة الفرعية ألفا التي تختلف بين الفقاريات والديدان الخيطية. إن استبدال αGly -153 المحفوظ بحمض الجلوتاميك المتماثل من الديدان الخيطية AChR يزيد بشكل كبير من فعالية الليفاميزول لتنشيط القنوات. يحدث نشاط القناة في مجموعات لها وضعان حركيان مختلفان. تكون حركية وضع الاحتمال المفتوح العالي متطابقة تقريبًا عندما يكون الناهض ACh أو levamisole. تم استنتاج أن αGly -153 يشارك في انخفاض فعالية الليفاميزول لتنشيط AChRs لعضلات الثدييات. عند التقاطع العصبي العضلي، أسيتيل كولين (ACh) 1 الاختصارات المستخدمة هي: AChR، مستقبل أسيتيل كولين النيكوتين ؛ ACh، أسيتيل كولين ؛ Popen، احتمال فتح القناة ؛ خلايا HEK، خلايا الكلى الجنينية البشرية. تتوسط النقل العصبي السريع عن طريق تنشيط مستقبلات النيكوتين (AChRs). AChRs في عضلات الديدان الخيطية هي أهداف للعلاج الكيميائي المضاد للديدان. الليفاميزول والبيرانتيل هما عقاران مضادان للديدان يستخدمان على نطاق واسع. من خلال الارتباط بـ AChR، فإنها تؤدي إلى إزالة الاستقطاب من العضلات الجسدية للديدان الخيطية. تعتمد فعالية هذه الأدوية على قدرتها على العمل كناهضات كاملة لـ AChRs في الديدان الخيطية (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ؛ 113: S137 - S156Crossref PubMed Google Scholar). أظهرت قياسات الانقباض وجهد الغشاء أن العضلات المحورية للديدان الخيطية أكثر حساسية 10–100 مرة للعمل الحاد للبيرانتيل والليفاميزول من عضلات الفئران (2Atchison W.D. Geary T.G. Manning B. VandeWaa E.A. Thompson D.P. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992; 112: 133-143 Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar). لم يتم بعد توضيح القواعد الجزيئية لهذه الانتقائية. تمت دراسة حركية تنشيط الديدان الخيطية AChRs بواسطة الليفاميزول في العديد من المستحضرات من العضلات الطفيلية (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137 - S156Crossref PubMed Google Scholar, 3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993 ؛ 108: 170-178 Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar)، ولكن لم يتم وصف تأثيره على عضلات الثدييات AChRs حتى الآن. تمت دراسة تأثيرات الليفاميزول على الخلايا العصبية البشرية α 3 β 2 و α 3 β 4 AChRs مؤخرًا (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003 ؛ 471: 9-20 Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar) مع طريقة مشبك الجهد. وقد تبين أن الليفاميزول يتصرف كناهض جزئي ضعيف، ومغير تفارغي، وحاصر قناة مفتوحة من AChRs العصبية (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003 ؛ 471: 9-20 Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). ACh مسؤول عن الانتقال العصبي العضلي في الديدان الخيطية (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ؛ 113: S137 - S156Crossref PubMed Google Scholar). في عضلة Caenorhabditis الأنيقة، تتكون AChRs المنشطة بالليفاميزول من الوحدة الفرعية unc -38، والتي تشفر وحدة فرعية α، و lev -1 و unc -29، والتي تشفر الوحدات الفرعية غير α (5Fleming JT Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. J. Neurosci. 1997 ؛ 17: 5843-5857 Crossref PubMed Google Scholar). أظهرت دراسات التعبير في بويضات Xenopus أن كلا من الوحدات الفرعية unc -38 و unc -29 ضرورية لوظيفة AChR (5Fleming JT Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997 ؛ 17: 5843-5857 Crossref PubMed Google Scholar). كلتا الوحدتين الفرعيتين مطلوبتان للتعبير عن المستقبلات الحساسة لليفاميزول في عضلات جدار الجسم لهذه الديدان الخيطية (6Richmond J.E. Jorgensen E.M. Nat. Neurosci. 1999 ؛ 2: 791-797 Crossref PubMed Scopus (356) الباحث العلمي من Google). تم استنساخ وحدات فرعية أخرى من الديدان الخيطية ألفا من الديدان الخيطية الطفيلية Trichostrongylus colubriformis (7Wiley LJ Weiss A.S. Sangster N.C. Li Q. Gene (Amst.). 1996 ؛ 182: 97-100 Crossref PubMed Scopus (22) الباحث العلمي من Google)، Haemonchus conturtus (8Hoekstra R. Visser A. Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Roos M.H. Mol. Biochem. Parasitol. 1997 ؛ 84: 79-187 Crossref Scopus (46) الباحث العلمي من Google)، و Ascaris suum (9Le Nove? re N. Changeux J.P. Nucleic Acid Res. 1999 ؛ 27: 340-342 Crossref PubMed Scopus (83) الباحث العلمي من Google)، مما يدل على تشابه 91.6 و 91 و 76 ٪ مع unc -38، على التوالي. يتم الحفاظ على السمات الهيكلية الرئيسية للوحدات الفرعية AChR بشكل لافت للنظر في علم السلالات من الكائنات الحية الأعلى إلى الديدان الخيطية. ومع ذلك، قد تؤدي البقايا المحفوظة بشكل مختلف بين الديدان الثديية والديدان الخيطية AChRs إلى عمل دوائي تفاضلي لمضادات الديدان في الديدان الخيطية AChRs. في هذه الدراسة، نستكشف لأول مرة تفاعل الليفاميزول مع AChRs لعضلات الثدييات على قناة واحدة ومستويات التيار العياني. تكشف نتائجنا أن الليفاميزول يظهر فعالية منخفضة للغاية لتنشيط القناة. في تركيزات الليفاميزول العالية، يساهم حصار القناة أيضًا في الحفاظ على احتمال منخفض لفتح القناة. في المقابل، ثبت أن الليفاميزول يعمل بمثابة ناهض قوي لعضلات الديدان الخيطية المختلفة AChRs (3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993; 108: 170-178 Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 10Lewis J.A. Wu C.H. Levine J.H. Berg H. Neuroscience. 1980 ؛ 5: 967-989 Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar, 11Harrow I.D. Gration K.F. Pestic. Sci. 1985; 16: 662-672 Crossref Scopus (99) Google Scholar, 12Martin R.J. Pennington A.J. Duittoz A.H. Robertson S. Kusel JR Parasitology. 1991 ؛ 102: 41-58 Crossref PubMed Scopus (37) الباحث العلمي من Google). وبالتالي، فإن هذا المركب المضاد للديدان يستغل الاختلافات علاجيًا من خلال تنشيط AChR للطفيلي بشكل انتقائي وليس للمضيف. لتحديد المخلفات التي تنطوي عليها هذه الانتقائية المختلفة، قمنا بدمج الطفرات الموجهة نحو الموقع في المخلفات المحفوظة بشكل مختلف بين الوحدات الفرعية α للعضلات من الديدان الخيطية والفقاريات، وقمنا بتقييم التغيرات في تنشيط الليفاميزول. تكشف نتائجنا أن حمض الجلوتاميك في الموضع 153، المحفوظ بشكل كبير في جميع الوحدات الفرعية للديدان الخيطية α المستنسخة حتى الآن، قد يشارك في التنشيط الفعال للديدان الخيطية AChRs بواسطة الليفاميزول. سيسهم توضيح الأساس الجزيئي لتنشيط مضادات الديدان AChRs بشكل كبير في تطوير علاجات أكثر انتقائية ضد الطفيليات وفهم كيفية تطور الطفيليات لمقاومة مضادات الديدان. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحدد محددات الوظيفة. تم نقل الطفرات الموجهة للموقع والتعبير عن خلايا AChR - HEK293 مع الفأر α (من النوع البري أو الطافر)، β، δ، و cDNAs باستخدام ترسيب فوسفات الكالسيوم بنسبة وحدة فرعية 2:1:1:1 لـ α: β: δ: Ω، على التوالي، بشكل رئيسي كما هو موضح سابقًا (13Bouzat C. Bren N. S. Neuron. 1994 ؛ 13: 1395-1402 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo AM Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998 ؛ 54: 146-153 Crossref PubMed Scopus (76) الباحث العلمي من Google). كما تم تضمين بروتين فلورسنت أخضر مشفر للبلازميد (الفانوس الأخضر) للتسجيلات للسماح بتحديد الخلايا المصابة تحت بصريات الفلورة. تم بناء الوحدات الفرعية الطافرة باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة إلى الموقع QuikChange™ (Stratagene). أكد رسم خرائط التقييد وتسلسل الحمض النووي جميع التركيبات. تم استخدام الخلايا لتسجيلات مشبك التصحيح بعد 48 ساعة من نقل العدوى. تم الحصول على تسجيلات مشبك التصحيح والتحليل الحركي - التسجيلات في التكوين المرفق بالخلية (15Hamill O.P. Marty A. Neher E. Sakmann B. Sigworth FJ Pfluegers Arch. 1981 ؛ 391: 85-100 Crossref PubMed Scopus (15149) الباحث العلمي من Google) عند 20 درجة مئوية (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994 ؛ 13: 1395-1402 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (134) الباحث العلمي من Google). تحتوي محاليل الماصات والحمامات على 142 مم KCl و 5.4 مم NaCl و 1.8 مم CaCl2 و 1.7 مم MgCl2 و 10 مم HEPES (الأس الهيدروجيني 7.4). تمت إضافة الأسيتيل كولين (ACh) أو الليفاميزول (Sigma) أو كلا العقارين إلى محلول الماصة. تم تسجيل تيارات أحادية القناة باستخدام مضخم مشبك تصحيح Axopatch 200 B (Axon Instruments، Inc.، CA)، تمت رقمنتها على فترات 5 ميكرو ثانية مع واجهة PCI -611E (National Instruments، Austin، TX)، تم تسجيلها على القرص الصلب لجهاز كمبيوتر باستخدام برنامج Acquire (Bruxton Corporation، Seattle، WA)، وتم اكتشافها بواسطة معيار عتبة نصف السعة باستخدام برنامج TAC 4.0.10 (Bruxton Corporation، Seattle، WA) عند عرض النطاق الترددي النهائي البالغ 10 كيلو هرتز. تم رسم مخططات زمنية مفتوحة ومغلقة باستخدام إحداثي لوغاريتمي وإحداثي جذر تربيعي وتم تركيبها على مجموع الأسس بأقصى احتمال باستخدام برنامج TACFit (Bruxton Corp.، Seattle، WA). تم تحديد المجموعات على أنها سلسلة من الأحداث المتقاربة التي تسبقها وتتبعها فترات مغلقة أطول من مدة محددة (tcrit )؛ تم أخذ هذه المدة كنقطة تقاطع للمكون الزمني المغلق السائد والمكون التالي في المخطط الزمني المغلق. تم التخلص من المجموعات التي تظهر فتحات مزدوجة. لكل تسجيل، تم اختيار المجموعات على أساس توزيعها للاحتمال المفتوح (Popen)، ومتوسط المدة المفتوحة، ومتوسط المدة المغلقة (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997 ؛ 109: 757-766 Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar، 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ؛ 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar، 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (46) الباحث العلمي من Google). تُظهر توزيعات Popen لـ AChR المتحولة αG 153E مكونين واضحين، تم تعريفهما على أنهما وضع Popen العالي (HPopen) و Popen المنخفض (LPopen). تم اختيار مجموعات من كل وضع أولاً للسماح بتحليل حركي منفصل لكل وضع. بالنسبة للتحليل، استخدمنا فقط المجموعات التي أظهرت وضع بوابة واحد فقط. بالنسبة لوضع Popen المرتفع الذي تم تنشيطه بواسطة ACh و levamisole، اقتصر التحليل الحركي على مجموعات، كل منها يعكس نشاط AChR واحد (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997 ؛ 109: 757-766 Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar، 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ؛ 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar، 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (46) الباحث العلمي من Google). تم تحليل الفترات المفتوحة والمغلقة الناتجة من المجموعات المختارة وفقًا للمخططات الحركية باستخدام خوارزمية الاحتمالية الكاملة القائمة على الفاصل الزمني (www.qub.buffalo.edu) (جناح QuB، جامعة ولاية نيويورك، بافالو). كان الوقت الضائع عادة 30 ميكرو ثانية. تم حساب دوال الكثافة الاحتمالية للمدد المفتوحة والمغلقة من ثوابت المعدل المجهزة والوقت الميت للأجهزة وتراكبها على الرسم البياني لوقت السكون التجريبي كما وصفه تشين وآخرون. (19Qin F. Auerbach A. Sachs F. Biophys. J. 1996 ؛ 70: 264-280 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (372) الباحث العلمي من Google). لم يتم قبول المعدلات المحسوبة إلا إذا كانت دوال كثافة الاحتمال الناتجة مناسبة بشكل صحيح للمخططات التكرارية التجريبية المفتوحة والمغلقة. تم تطبيق النهج الآخر على وضع بوابة Popen المنخفض لـ αG 153E AChR وعلى AChRs من النوع البري الذي تم تنشيطه بواسطة levamisole، حيث لوحظت مجموعات أقل وضوحًا أو لم يتم ملاحظتها. قمنا بتحليل سلوك رشقات نارية من نشاط قناة واحدة أثارتها تركيزات ناهضات منخفضة، حيث لا يمكن رؤية أي مجموعات وكتلة غير مهمة، على أساس مخطط التنشيط الكلاسيكي 1، حيث يرتبط اثنان من الناهضات (A) بالمستقبل (R) في حالة الراحة مع معدلات الارتباط k+1 و k+2 ويفصلان مع معدلات k -1 و k -2. يتم احتلال AChRs بواسطة جزيئين ناهضين يفتحان بمعدل β ويغلقان بمعدل α. تحتوي الانفجارات عند تركيزات ناهضة منخفضة على معلومات حول الحالة المفتوحة والحالة المغلقة المجاورة مباشرة (16 وانغ إتش إل أويرباخ إيه برين إن أونو كيه إنجل إيه جي سين إس إم جي جنرال فيزيول. 1997 ؛ 109: 757-766 Crossref PubMed Scopus (117) الباحث العلمي من Google). لذلك، يمكن الحصول على تقديرات β و α و k -2 من متوسط مدة المكون الأقصر للمخطط الزمني المغلق (τc)، ومساحته النسبية (Aτc)، ومتوسط مدة الانفجار (τb) على النحو التالي: τc = 1/(β + k -2) ؛ Aτc = β/(β + k -2) ؛ τb = (1 + β/k -2) (1/α). تسجيلات التيار العياني - بالنسبة لتسجيلات التصحيح الخارجي، يحتوي محلول الماصة على 140 مم KCl و 5 مم EGTA و 5 مم MgCl2 و 10 مم HEPES (درجة الحموضة 7.3). يحتوي المحلول خارج الخلية على 150 مم كلوريد الصوديوم، 5.6 مم كلوريد الكالسيوم، 1.8 مم كلوريد الكالسيوم، 1 مم كلوريد المغنيسيوم، و 10 مم هيبس (درجة الحموضة 7.3). تم استئصال الرقعة في هذا التكوين ونقلها إلى موضعها عند تدفق نظام التروية كما هو موضح من قبل (20Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001; 60: 235-243 Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 21Gumilar F. Arias H.R. Spitzmaul G. Bouzat C. Neuropharmacol. 2003 ؛ 45: 964-976 Crossref PubMed Scopus (59) الباحث العلمي من Google). يسمح نظام التروية بتبادل سريع (0.1–1 مللي ثانية) للمحلول الذي يستحم في الرقعة. تم تطبيق سلسلة من تطبيقات المحلول خارج الخلية التي تحتوي على ACh أو levamisole أو كلا العقارين على الرقعة خلال 150 مللي ثانية. تم ترشيح التيارات العيانية عند 5 كيلو هرتز، ورقمنتها عند 20 كيلو هرتز، وتخزينها على القرص الصلب. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج IgorPro (WaveMetrics Inc.، Lake Oswego، OR). تم حساب متوسط تيار المجموعة لـ 5–10 آثار تيار فردية. عادة ما يتم تركيب التيارات المتوسطة بواسطة دالة أسية واحدة: I(t) = I0 exp(- t/τd) + I∞ حيث I0 و I∞ هما قيمتي الذروة والتيار في الحالة الثابتة، على التوالي، و τd هو ثابت وقت الاضمحلال الذي يقيس الاضمحلال الحالي بسبب إزالة الحساسية. تمت محاذاة السجلات الحالية مع بعضها البعض عند النقطة التي وصل فيها التيار إلى 50 ٪ من مستواه الأقصى. التيارات أحادية القناة التي ينشطها ليفاميزول- ليفاميزول هي ناهض كامل لعضلة الديدان الخيطية AChR (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ؛ 113: S137 - S156Crossref PubMed Google Scholar). في هذه الدراسة، قمنا بتقييم ما إذا كان هذا الدواء المضاد للديدان يعمل أيضًا على AChRs لعضلات الثدييات. ولتحقيق هذه الغاية، سجلنا أولاً قنوات مفردة من الخلايا التي تعبر عن AChRs لعضلات البالغين (الشكل 1). كما هو موضح في هذا الشكل، فإن الليفاميزول قادر على تنشيط AChRs للثدييات. ومع ذلك، فإن فتحات القنوات أكثر إيجازًا بكثير من تلك التي يتم تنشيطها بواسطة الناقل العصبي الداخلي ACh. يمكن تركيب توزيعات الوقت المفتوح لـ 1 ميكرومتر من AChRs المنشط بالليفاميزول بشكل جيد بواسطة مكون رئيسي 220 ± 20 ميكرو ثانية (المساحة النسبية >0.7) (الشكل 1). مدة المكون المفتوح الرئيسي 4 أضعاف أقصر من تلك التي لوحظت عند 1 ميكرومتر ACh (860 ± 80 ميكرو ثانية، الشكل. 1) (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994 ؛ 13: 1395-1402 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo AM Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998 ؛ 54: 146-153 Crossref PubMed Scopus (76) الباحث العلمي من Google). زيادة تركيز الليفاميزول من 1 إلى 300 ميكرومتر لا ينتج التجميع العنقودي النموذجي الذي لوحظ مع ناهضات كاملة، مثل ACh. عند تركيزات ACh أعلى من 10 ميكرومتر، تفتح AChRs من النوع البري في مجموعات من حلقات التنشيط المحددة جيدًا (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ؛ 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) الباحث العلمي من Google) (الشكل 1). تبدأ كل حلقة تنشيط بانتقال مستقبل واحد من الحالة غير الحساسة إلى الحالة القابلة للتنشيط وتنتهي بالعودة إلى الحالة غير الحساسة. عند 300 ميكرومتر ACh، يكون احتمال فتح القناة داخل الكتلة هو 1 (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ؛ 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) الباحث العلمي من Google ؛ الشكل 1). على النقيض من ذلك، عندما يتم تنشيط AChRs بواسطة الليفاميزول، حتى عند تركيزات تصل إلى 300 ميكرومتر، لا يتم ملاحظة المجموعات (الشكل 1). تشير هذه النتائج إلى أن الليفاميزول يفتح AChRs للثدييات بزمن استجابة أكبر ويغلقها أسرع من ACh. تؤدي زيادة تركيز الليفاميزول من 1 إلى 300 ميكرومتر إلى انخفاض كبير في الفترات المفتوحة. يمكن تركيب المدرجات الزمنية المفتوحة لـ AChRs التي تم تنشيطها بواسطة ليفاميزول 300 ميكرومتر بواسطة أسي واحد بمتوسط وقت فتح 80 ± 9 ميكرو ثانية (الشكل 1). يشير هذا الانخفاض المعتمد على التركيز في متوسط وقت الفتح إلى أنه بالإضافة إلى قدرته على تنشيط AChRs للثدييات، قد يعمل الليفاميزول كحاجز قناة مفتوح (انظر أدناه). التيارات العيانية التي يتم تنشيطها بواسطة الليفاميزول - لتقييم فعالية الليفاميزول في تنشيط AChRs للثدييات، سجلنا تيارات عيانية من بقع خارجية تتخللها بسرعة الليفاميزول. يوضح الشكل 2 تيارات المجموعة التي تم الحصول عليها من رقعة خارجية واحدة معرضة لتطبيقات قصيرة من 100 ميكرومتر ACh (التحكم) و 100 ميكرومتر ليفاميزول. في بيانات التحكم، يصل التيار إلى الذروة بعد 0.1–1 مللي ثانية ثم يتحلل مع ثابت زمني (τd) يبلغ حوالي 20–30 مللي ثانية بسبب إزالة الحساسية (الشكل 2) (20Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001; 60: 235-243 Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). يبلغ تيار الذروة حوالي 3 ٪ فقط عندما تتعرض نفس الرقعة لليفاميزول 100 ميكرومتر. علاوة على ذلك، لوحظت في العديد من البقع قنوات واحدة فقط بعد التروية باستخدام الليفاميزول. تؤكد هذه النتائج الفعالية المنخفضة للدواء لتنشيط AChRs للثدييات. بالنظر إلى أن تجارب التسجيل أحادية القناة تشير إلى أن الليفاميزول قد يمنع أيضًا AChRs (الشكل 1)، فقد درسنا عمله كحاجز للقناة في غياب ووجود ACh. تزيح زيادة تركيز الليفاميزول بشكل منهجي إلى فترات أقصر التوزيعات الزمنية المفتوحة لقنوات AChR التي يتم تنشيطها إما بمقدار 1 ميكرومتر ACh (الشكل 3) أو عن طريق الليفاميزول (الشكل 1). استخدمنا نموذج الحظر الخطي الكلاسيكي لوصف تأثير الليفاميزول كحاجز قناة مفتوح كما هو موضح في المخطط 2، حيث يشير C إلى مغلق، ويشير O إلى مفتوح، ويشير OB إلى الحالات المحظورة. بالاتفاق مع المخطط 2، لوحظ وجود علاقة خطية بين مقلوب متوسط وقت الفتح وتركيز الليفاميزول ([B]) (الشكل 4 أ). القيمة المحسوبة لثابت المعدل الأمامي لتفاعل الحجب (k+b في المخطط 2)، المعطاة بواسطة ميل المنحنى، هي 30 × 106 و 25 × 106m -1 s -1 للقنوات التي تعمل بـ ACh - أو levamisole. وبالتالي، يتم حظر AChRs التي يتم تنشيطها إما بواسطة ACh أو levamisole بواسطة levamisole بمعدل مماثل. معدل الإغلاق الظاهري، المحسوب من التقاطع مع المحور y، هو 5600 s -1 لـ AChRs المنشطة بالليفاميزول و 1600 s -1 للقنوات المنشطة بـ ACh. تتفق هذه القيمة مع سعر إغلاق القنوات التي يتم تنشيطها بواسطة ACh والتي يتم حسابها عن طريق التحليل الحركي (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ؛ 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar، 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar).Fig. 4 توصيف حصار الليفاميزول. أ، تم تسجيل قنوات AChR في غياب (•) ووجود (○) 1 ميكرومتر ACh بالإضافة إلى الليفاميزول بتركيزات نهائية مختلفة. تم الحصول على متوسط أوقات الفتح من الرسوم البيانية للوقت المفتوح المقابلة. يتم تركيب البيانات بواسطة المعادلة 1/متوسط وقت الفتح = α + k+b [levamisole]، حيث k+b هو معدل ارتباط levamisole لكتلة القناة، و α هو معدل إغلاق القناة الظاهري. تظهر البيانات كمتوسط ± S.D. من 3–5 بقع. ب، تم تسجيل تيارات AChR في وجود 1 ميكرومتر ACh بالإضافة إلى الليفاميزول. تم الحصول على متوسط الوقت المحجوب○ (•) والمنطقة النسبية الخاصة به من الرسوم البيانية الزمنية المغلقة المقابلة. يتم عرض البيانات كمتوسط ± S.D. من 3–5 تسجيلات مختلفة لكل حالة. جهد الغشاء، –70 مللي فولت. ج، العلاقة بين متوسط الوقت المحجوب وجهد الغشاء. تركيز الليفاميزول، 50 ميكرومتر. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± S.D. من 3–5 بقع. d، تيارات التروية السريعة التي يتم تنشيطها بواسطة 1 مم ACh (التحكم) وحدها وجنباً إلى جنب مع 100 ميكرومتر من الليفاميزول (+ الليفاميزول). تم تسجيل التيارات عند –70 مللي فولط (التيارات الهابطة) و +70 مللي فولط (التيارات الصاعدة). يمثل كل تيار متوسط 5–10 سجلات. عرض تحميل عارض الصورة الكبيرة (PPT) لتحليل الحصار بواسطة الليفاميزول، درسنا التوزيعات الزمنية المغلقة لـ AChRs التي تم تنشيطها بواسطة 1 ميكرومتر ACh في وجود الليفاميزول. في غيابها، تُظهر المدرجات الزمنية المغلقة المقابلة لقنوات 1 ميكرومتر ACh - activated مكونًا رئيسيًا تعتمد مدته على عدد القنوات في الرقعة (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ؛ 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) الباحث العلمي من Google) (الشكل 3). يؤدي وجود الليفاميزول إلى تغيير كبير في التوزيعات الزمنية المغلقة للقنوات التي يتم تنشيطها بواسطة ACh، ويتم ملاحظة مكون مغلق جديد يبلغ حوالي 175 ميكرو ثانية بشكل منهجي (الشكل 3). لا تتغير مدة هذا المكون مع تركيز الليفاميزول، ولكن تزداد مساحته كدالة لتركيزه (الشكل 4 ب). لذلك من الممكن افتراض أن هذا المكون المغلق يتوافق مع الحصار الذي يفرضه ليفاميزول على القنوات المنشطة بـ ACh (1/k - b في المخطط 2). من مدة هذا المكون المغلق (1/k - b) يتم الحصول على قيمة 5700 s -1 لـ k - b. وبالتالي، فإن ثابت التفكك الظاهري لعملية الحجب، KB = k - b/k+b، هو 190 ميكرومتر عند جهد غشائي قدره –70 مللي فولط. في تركيزات الليفاميزول التي تزيد عن 100 ميكرومتر، لا تزيد المساحة المسدودة كدالة للتركيز. قيم المكونات المغلقة والمناطق النسبية هي 175 ± 12 ميكرو ثانية و 0.32 ± 0.03، و 220 ± 15، و 0.33 ± 0.08 ميكرو ثانية لليفاميزول 100 و 300 ميكرومتر، على التوالي. لذلك، عند التركيزات الأعلى، تنحرف آلية كتلة القناة عن المخطط 2. تزداد مدة الفترات المحظورة مع ارتفاع إمكانات الغشاء السالب، مما يشير إلى أن عملية إلغاء الحظر تعتمد على الجهد (الشكل 4 ج). يتم تأكيد اعتماد الجهد للتأثير من خلال تسجيلات التصحيح الخارجية (الشكل 4 د). عند جهد الغشاء الموجب، لا يؤثر ليفاميزول 100 ميكرومتر على ثابت اضمحلال التيارات الناتجة عن 1 مم ACh، ويمكن تركيب البيانات بواسطة اضمحلال أسي واحد مشابه للتحكم (22.5 مللي ثانية). في المقابل، عند –70 مللي فولط، يسبق التحلل السريع الأولي إزالة الحساسية. يرجع هذا المكون السريع (حوالي 0.5 مللي ثانية) إلى حصار القناة المفتوحة. يبلغ ثابت وقت الاضمحلال البطيء، الذي يتوافق مع إزالة الحساسية، 19.4 ± 1.8 مللي ثانية. لا يتأثر تيار الذروة، مما يشير إلى أنه عند نسبة التركيزات المستخدمة، لا يمكن أن يتنافس الليفاميزول مع ACh لتنشيط القناة. باختصار، يشير توصيف الحصار إلى أن الليفاميزول يعمل كحاجز قناة مفتوح نموذجي بتركيزات أقل من 100 ميكرومتر. تكشف مقارنة التسلسل عن المخلفات الرئيسية التي يتم الحفاظ عليها بشكل تفاضلي بين الوحدات الفرعية لعضلات الثدييات والديدان الخيطية (الشكل 5). لتحديد ما إذا كانت هذه المخلفات متورطة في السلوك التفاضلي للأدوية المضادة للديدان في العضلات الطفيلية والثدييات، استبدلناها بالمخلفات المكافئة في الديدان الخيطية، والخلايا المتناقلة مع الوحدات الفرعية α المتحولة والوحدات الفرعية غير α من النوع البري، وقمنا بتقييم نشاط القناة الناجم عن الليفاميزول. تزداد فعالية الليفاميزول لتنشيط AChRs الثديية بشكل كبير عندما يتم استبدال بقايا αGly -153 بحمض الجلوتاميك. كما هو موضح في الشكل 6، يظهر نشاط القناة الآن في مجموعات يسهل التعرف عليها عند 50 ميكرومتر من الليفاميزول. في المقابل، لم يلاحظ أي تغييرات في تنشيط الليفاميزول (1–100 ميكرومتر) من AChRs التي تحمل إما الطفرات αD 152S، αS 154N، أو إدخال البرولين بعد αTyr -190 (α 191insP). 6 تنشيط AChRs الطافرة بواسطة الليفاميزول. تم تسجيل القنوات التي تم تنشيطها بواسطة ليفاميزول 50 ميكرومتر من خلايا HEK التي تعبر عن AChRs التي تحتوي على وحدات فرعية من النوع البري والمتحور αD 152S و αG 153E و αS 154N و α 191insP. إلى اليسار، يتم عرض التيارات عند عرض نطاق ترددي 9 كيلو هرتز مع فتحات القنوات على أنها انحرافات صاعدة. جهد الغشاء، –70 مللي فولط. الحق، والمخططات الزمنية المغلقة من AChRs تحمل وحدة فرعية متحولة محددة. تمثل البيانات 4–6 تسجيلات لكل حالة. عرض مجموعات تحميل عارض الصورة الكبيرة (PPT) من αG 153E AChR يمكن تحديدها بتركيزات أعلى من 10 ميكرومتر. ويرافق تجميع الأحداث الافتتاحية تغييرات مهمة في الرسوم البيانية الزمنية المغلقة. يتم إزاحة المكون الرئيسي للتوزيعات الزمنية المغلقة، والذي يتوافق مع الإغلاق داخل المجموعات، إلى فترات أقصر كدالة لتركيز الليفاميزول (الشكل 7). للكشف عن العواقب الميكانيكية لوجود حمض الجلوتاميك عند α 153، قمنا بتسجيل القنوات التي يتم تنشيطها بواسطة مجموعة من تركيزات الليفاميزول (0.1 نانومتر إلى 300 ميكرومتر) وقمنا بتحليل نشاط فتحات القناة الواحدة في مجموعات. في موازاة ذلك، قارنا حركية التنشيط بواسطة ACh الناهض الكامل. عند فحصه بالتفصيل، يمكن ملاحظة أن مجموعات αG 153E التي يتم تنشيطها إما بواسطة ACh أو levamisole ليست متجانسة، مما يشير إلى أن مستقبل الطفرة هذا ينشط في أوضاع حركية مميزة (الشكل 8). أظهر توزيع قيم Popen مكونين مختلفين (انظر "الإجراءات التجريبية "). لذلك قمنا بتصنيف المجموعات على أنها تنتمي إلى وضعين رئيسيين للبوابات: وضع HPopen ووضع LPopen. في جميع تركيزات المحفزات، تألف وضع HPopen من فتحات كانت أطول بكثير وإغلاق داخل مجموعات كانت أكثر إيجازًا من تلك الموجودة في وضع LPopen (الجدول الأول). بناءً على توزيعات Popen، اخترنا المجموعات المقابلة لكل وضع وقمنا بتحليلها كدالة لتركيز الناهض (الجدول 1 والشكل 8) .خصائص قناة IC من αG 153E AChRs الطافرة التي تم تنشيطها بواسطة ACh أو levamisoleKinetic modeAChLevamisoleτoτcPopenμmmsHPopen0.00011.560.10.930.011.71 ± 0.240.08 ± 0.0070.98 ± 0.0090.11.78 ± 0.050.07 ± 0.0050.96 ± 0.002100.380.320.52500.260.320.451000.210.260.412.40 ± 0.200.05 ± 0.0020.98 ± 0.00113.20 ± 0.760.05 ± 0.0080.98 ± 0.002104.30 ± 0.670.05 ± 0.0030.98 ± 0.002502.70 ± 0.660.05 ± 0.0140.97 ± 0.0091002.80 ± 0.570.04 ± 0.0080.97 ± 0.005LPopen0.010.43 ± 0.07NDND.31 ± 0.0010ND.27 ± 0.0100.007 ± 6.50019 ± 0.000.90 ± 0.002.0027 ± 0.0027.001 ± 0.0025.08 ± 0.05 ± 0.0825.005 ± 0.00N ± 0.00510.001 ± 0.00N ± 0.110.001 ± 0.110 ± 0.510.01 ± 0.11 ± 1.20 ± 0.02 ± 0.03 ± 0.21 ± 1.20 ± 0.0220 ± 0.03 ± 0.0220 ± 0.02202 ± 0.02 ± 0.0220 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.0220 ± 0.02201 ± 0.02201 ± 0.0220 ± 0.02 μ2 μ20 μ1 μm μm μt. 8). تظهر بقية الفتحات كأحداث معزولة. يبلغ بوبين المحسوب لهذه المجموعات حوالي 1 في 1 نانومتر من أي من الناهضات. الأكثر إثارة للاهتمام، لا توجد اختلافات كبيرة في الخصائص بين مجموعات ACh - أو الليفاميزول المنشطة (الشكل 8 والجدول الأول). لذلك، عند تركيزات ناهضة منخفضة، يبدو أن تنشيط الليفاميزول لـ αG 153E AChR لا يمكن تمييزه حركيًا عن تنشيط ACh. كما لوحظت مجموعات من وضع HPopen بتركيزات أعلى من كلا الناهضين. ومع ذلك، فإن متوسط مدة القناة وكذلك انخفاض بوبين عند تركيزات أعلى من الليفاميزول بسبب حصار القناة (الجدول الأول). مجموعات البوبن المنخفضة - كمركز للناهضاتTranslated Description (French)
Le lévamisole est un agent anthelminthique qui exerce son effet thérapeutique en agissant comme un agoniste complet du récepteur nicotinique (AChR) du muscle nématode. Son action sur le muscle mammifère AChR n'a pas été élucidée à ce jour malgré sa large utilisation comme anthelminthique chez l'homme et le bétail. Par des enregistrements de courant à canal unique et macroscopique, nous avons étudié l'interaction du lévamisole avec le muscle mammifère AChR. Le lévamisole active les AChR des mammifères. Cependant, les ouvertures à canal unique sont plus brèves que celles activées par l'acétylcholine (ACh) et n'apparaissent pas en grappes à des concentrations élevées. Le courant de crête induit par le lévamisole est d'environ 3% de celui activé par l'ACh. Ainsi, l'anthelminthique agit comme un agoniste faible de l'AChR mammifère. Le lévamisole produit également un blocage à canal ouvert de l'AChR. L'affinité apparente pour le bloc (190 μm à –70 mV) est similaire à celle du nématode AChR, ce qui suggère que des différences dans la cinétique d'activation des canaux régissent la sensibilité différente du nématode et du muscle mammifère aux anthelminthiques. Pour identifier la base structurelle de cette sensibilité différente, nous avons effectué une mutagenèse ciblant les résidus dans la sous-unité α qui diffèrent entre les vertébrés et les nématodes. Le remplacement de l'αGly-153 conservé par l'acide glutamique homologue du nématode AChR augmente significativement l'efficacité du lévamisole pour activer les canaux. L'activité du canal a lieu dans des grappes ayant deux modes cinétiques différents. La cinétique du mode à forte probabilité d'ouverture est presque identique lorsque l'agoniste est l'ACh ou le lévamisole. On conclut que αGly-153 est impliqué dans la faible efficacité du lévamisole pour activer les AChR musculaires des mammifères. Le lévamisole est un agent anthelminthique qui exerce son effet thérapeutique en agissant comme un agoniste complet du récepteur nicotinique (AChR) du muscle nématode. Son action sur le muscle mammifère AChR n'a pas été élucidée à ce jour malgré sa large utilisation comme anthelminthique chez l'homme et le bétail. Par des enregistrements de courant à canal unique et macroscopique, nous avons étudié l'interaction du lévamisole avec le muscle mammifère AChR. Le lévamisole active les AChR des mammifères. Cependant, les ouvertures à canal unique sont plus brèves que celles activées par l'acétylcholine (ACh) et n'apparaissent pas en grappes à des concentrations élevées. Le courant de crête induit par le lévamisole est d'environ 3% de celui activé par l'ACh. Ainsi, l'anthelminthique agit comme un agoniste faible de l'AChR mammifère. Le lévamisole produit également un blocage à canal ouvert de l'AChR. L'affinité apparente pour le bloc (190 μm à –70 mV) est similaire à celle du nématode AChR, ce qui suggère que des différences dans la cinétique d'activation des canaux régissent la sensibilité différente du nématode et du muscle mammifère aux anthelminthiques. Pour identifier la base structurelle de cette sensibilité différente, nous avons effectué une mutagenèse ciblant les résidus dans la sous-unité α qui diffèrent entre les vertébrés et les nématodes. Le remplacement de l'αGly-153 conservé par l'acide glutamique homologue du nématode AChR augmente significativement l'efficacité du lévamisole pour activer les canaux. L'activité du canal a lieu dans des grappes ayant deux modes cinétiques différents. La cinétique du mode à forte probabilité d'ouverture est presque identique lorsque l'agoniste est l'ACh ou le lévamisole. On conclut que αGly-153 est impliqué dans la faible efficacité du lévamisole pour activer les AChR musculaires des mammifères. À la jonction neuromusculaire, l'acétylcholine (ACh) 1Les abréviations utilisées sont : AChR, récepteur nicotinique de l'acétylcholine ; ACh, acétylcholine ; Popen, probabilité d'ouverture du canal ; cellules HEK, cellules rénales embryonnaires humaines. médient la neurotransmission rapide en activant les récepteurs nicotiniques (AChR). Les AChR dans le muscle nématode sont des cibles pour la chimiothérapie anthelminthique. Le lévamisole et le pyrantel sont deux anthelminthiques largement utilisés. En se liant à l'AChR, ils entraînent une dépolarisation du muscle somatique des nématodes. L'efficacité de ces médicaments repose sur leur capacité à agir comme des agonistes complets des AChR chez les nématodes (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ; 113 : S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). Les mesures de la contractilité et du potentiel membranaire ont montré que le muscle axial du nématode est 10 à 100 fois plus sensible à l'action aiguë du pyrantel et du lévamisole que le muscle du rat (2Atchison W.D. Geary T.G. Manning B. VandeWaa e.a. Thompson D.P. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992 ; 112: 133-143Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar). Les bases moléculaires de cette sélectivité n'ont pas encore été élucidées. La cinétique d'activation des AChR des nématodes par le lévamisole a été étudiée dans plusieurs préparations de muscle parasite (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ; 113 : S137-S156Crossref PubMed Google Scholar, 3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993 ; 108: 170-178Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar), mais son action sur les AChR musculaires de mammifères n'a pas été décrite à ce jour. Les effets du lévamisole sur les AChRs α3β2 et α3β4 neuronales humaines ont été étudiés récemment (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003 ; 471: 9-20Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar) avec la méthode du voltage clamp. Il a été montré que le lévamisole se comporte comme un agoniste partiel faible, un modulateur allostérique et un bloqueur à canal ouvert des AChR neuronaux (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003 ; 471: 9-20Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). L'ACh est responsable de la transmission neuromusculaire chez les nématodes (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ; 113 : S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). Dans le muscle Caenorhabditis elegans, les AChR activés par le lévamisole sont composés de la sous-unité unc-38, qui code une sous-unité α, et de lev-1 et unc-29, qui codent des sous-unités non α (5Fleming J.T. Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997 ; 17: 5843-5857Crossref PubMed Google Scholar). Les études d'expression dans les ovocytes de Xenopus ont montré que les sous-unités unc-38 et unc-29 sont nécessaires à la fonction AChR (5Fleming J.T. Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard e.a. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997 ; 17: 5843-5857Crossref PubMed Google Scholar). Les deux sous-unités sont nécessaires à l'expression des récepteurs sensibles au lévamisole dans les muscles de la paroi corporelle de ces nématodes (6Richmond J.E. Jorgensen E.M. Nat. Neurosci. 1999 ; 2: 791-797Crossref PubMed Scopus (356) Google Scholar). D'autres sous-unités α de nématodes ont été clonées à partir des nématodes parasites Trichostrongylus colubriformis (7Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Li Q. Gene (Amst.). 1996 ; 182: 97-100Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar), Haemonchus conturtus (8Hoekstra R. Visser A. Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Roos M.H. Mol. Biochem. Parasitol. 1997 ; 84: 79-187Crossref Scopus (46) Google Scholar), et Ascaris suum (9Le Novère N. Changeux J.P. Nucleic Acid Res. 1999 ; 27: 340-342Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar), montrant une similitude de 91,6, 91 et 76% avec unc-38, respectivement. Les principales caractéristiques structurelles des sous-unités AChR sont remarquablement conservées dans la phylogénie des organismes supérieurs au nématode. Cependant, les résidus conservés différemment entre les AChR des mammifères et des nématodes peuvent entraîner une action pharmacologique différentielle des anthelminthiques au niveau des AChR. Dans cette étude, nous explorons pour la première fois l'interaction du lévamisole avec les AChR musculaires de mammifères aux niveaux de canal unique et de courant macroscopique. Nos résultats révèlent que le lévamisole présente une efficacité extrêmement faible pour l'activation des canaux. À des concentrations élevées de lévamisole, le blocage des canaux contribue également à maintenir une faible probabilité d'ouverture des canaux. En revanche, il a été démontré que le lévamisole agit comme un agoniste puissant de différents AChR musculaires de nématodes (3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993 ; 108: 170-178Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 10 Lewis J.A. Wu C.H. Levine J.H. Berg H. Neuroscience. 1980 ; 5: 967-989Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar, 11 Harrow I.D. Gration K.F. Pestic. Sci. 1985 ; 16: 662-672Crossref Scopus (99) Google Scholar, 12Martin R.J. Pennington A.J. Duittoz A.H. Robertson S. Kusel J.R. Parasitology. 1991 ; 102: 41-58Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). Ainsi, ce composé anthelminthique exploite thérapeutiquement les différences en activant sélectivement l'AChR du parasite et non celui de l'hôte. Pour identifier les résidus impliqués dans cette sélectivité différente, nous avons combiné la mutagenèse dirigée au niveau des résidus conservés de manière différentielle entre les sous-unités α musculaires des nématodes et des vertébrés, et nous avons évalué les changements dans l'activation du lévamisole. Nos résultats révèlent que l'acide glutamique en position 153, qui est hautement conservé dans toutes les sous-unités α des nématodes clonées à ce jour, peut être impliqué dans l'activation puissante des AChR des nématodes par le lévamisole. L'élucidation de la base moléculaire de l'activation anthelminthique des AChR contribuera grandement au développement de thérapies plus sélectives contre les parasites et à la compréhension de la façon dont les parasites développent une résistance aux anthelminthiques. En outre, il identifie les déterminants de la fonction. La mutagénèse dirigée et l'expression des cellules AChR-HEK293 ont été transfectées avec des ADNc α (de type sauvage ou mutants), β, δ et ? de souris en utilisant la précipitation de phosphate de calcium à un rapport de sous-unités de 2:1:1: 1 pour α : β :δ : ?, respectivement, principalement comme décrit précédemment (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994 ; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo A.M. Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998 ; 54: 146-153Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). Un plasmide codant pour la protéine fluorescente verte (lanterne pGreen) a également été inclus pour les enregistrements afin de permettre l'identification des cellules transfectées sous optique de fluorescence. Les sous-unités mutantes ont été construites à l'aide du kit de mutagenèse dirigée QuikChange™ (Stratagene). La cartographie des restrictions et le séquençage de l'ADN ont confirmé toutes les constructions. Les cellules ont été utilisées pour les enregistrements de patch clamp 48 h après la transfection. Patch Clamp Recordings and Kinetic Analysis—Recordings were obtained in the cell-attached configuration (15Hamill O.P. Marty A. Neher E. Sakmann B. Sigworth F.J. Pfluegers Arch. 1981 ; 391: 85-100Crossref PubMed Scopus (15149) Google Scholar) à 20 °C (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994 ; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar). Les solutions pour bain et pipette contenaient 142 mm de KCl, 5,4 mm de NaCl, 1,8 mm de CaCl2, 1,7 mm de MgCl2 et 10 mm d'HEPES (pH 7,4). L'acétylcholine (ACh), le lévamisole (Sigma) ou les deux médicaments ont été ajoutés à la solution pour pipette. Les courants à canal unique ont été enregistrés à l'aide d'un amplificateur à patch clamp Axopatch 200 B (Axon Instruments, Inc., CA), numérisés à des intervalles de 5 μs avec l'interface PCI-611E (National Instruments, Austin, TX), enregistrés sur le disque dur d'un ordinateur à l'aide du programme Acquire (Bruxton Corporation, Seattle, WA), et détectés par le critère de seuil de demi-amplitude à l'aide du programme TAC 4.0.10 (Bruxton Corporation, Seattle, WA) à une bande passante finale de 10 kHz. Les histogrammes de temps ouverts et fermés ont été tracés en utilisant une abscisse logarithmique et une ordonnée racine carrée et ajustés à la somme des exponentielles par vraisemblance maximale en utilisant le programme TACFit (Bruxton Corp., Seattle, WA). Les grappes ont été identifiées comme une série d'événements étroitement espacés précédés et suivis d'intervalles fermés plus longs qu'une durée spécifiée (tcrit) ; cette durée a été prise comme point d'intersection de la composante temporelle fermée prédominante et de la suivante dans l'histogramme temporel fermé. Les grappes présentant des doubles ouvertures ont été éliminées. Pour chaque enregistrement, les grappes ont été sélectionnées sur la base de leur distribution de probabilité ouverte (Popen), de durée moyenne ouverte et de durée moyenne fermée (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997 ; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002 ; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar). Les distributions popen du mutant αG153E AChR montrent deux composants clairs, qui ont été définis comme le mode high Popen (HPopen) et low Popen (LPopen). Les grappes de chaque mode ont d'abord été sélectionnées pour permettre une analyse cinétique distincte pour chaque mode. Pour l'analyse, nous n'avons utilisé que des grappes qui ne montraient qu'un seul mode de déclenchement. Pour le mode Popen élevé activé par l'ACh et le lévamisole, l'analyse cinétique a été limitée aux grappes, chacune reflétant l'activité d'un seul AChR (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997 ; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002 ; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar). Les intervalles ouverts et fermés résultants des grappes sélectionnées ont été analysés selon des schémas cinétiques à l'aide d'un algorithme de pleine probabilité basé sur les intervalles (www.qub.buffalo.edu) (suite QuB, State University of New York, Buffalo). Le temps mort était généralement de 30 μs. Les fonctions de densité de probabilité des durées ouverte et fermée ont été calculées à partir des constantes de vitesse ajustées et du temps mort de l'instrumentation et superposées à l'histogramme expérimental du temps de séjour tel que décrit par Qin et al. (19Qin F. Auerbach A. Sachs F. Biophys. J. 1996 ; 70: 264-280Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (372) Google Scholar). Les taux calculés n'ont été acceptés que si les fonctions de densité de probabilité résultantes correspondaient correctement aux histogrammes expérimentaux ouverts et fermés. L'autre approche a été appliquée au mode de déclenchement à faible Popen de l'AChR αG153E et aux AChR de type sauvage activés par le lévamisole, dans lesquels moins de clusters clairs ou pas de clusters ont été observés. Nous avons analysé le comportement des sursauts d'activité à canal unique provoqués par de faibles concentrations d'agonistes, où aucun groupe ne peut être vu et le blocage est insignifiant, sur la base du schéma d'activation classique 1, où deux agonistes (A) se lient au récepteur (R) à l'état de repos avec des taux d'association k+1 et k+2 et se dissocient avec les taux k–1 et k–2. Les AChR occupées par deux molécules agonistes s'ouvrent avec le taux β et se ferment avec le taux α. Les éclats à faibles concentrations d'agonistes contiennent des informations sur l'état ouvert et l'état fermé immédiatement adjacent (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997 ; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). Par conséquent, les estimations de β, α et k–2 peuvent être obtenues à partir de la durée moyenne de la composante plus brève de l'histogramme temporel fermé (τc), de sa surface relative (Aτc) et de la durée moyenne des rafales (τb) comme suit : τc = 1/(β + k–2) ; Aτc = β/(β + k–2) ; τb = (1 + β/k–2) (1/α). Enregistrements de courant macroscopiques - Pour les enregistrements de patchs extérieurs, la solution de pipette contenait 140 mm de KCl, 5 mm d'EGTA, 5 mm de MgCl2 et 10 mm d'HEPES (pH 7,3). La solution extracellulaire contenait 150 mm de NaCl, 5,6 mm de KCl, 1,8 mm de CaCl2, 1 mm de MgCl2 et 10 mm d'HEPES (pH 7,3). Le patch a été excisé dans cette configuration et mis en position à la sortie d'un système de perfusion comme décrit précédemment (20 Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001 ; 60: 235-243Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 21Gumilar F. Arias H.R. Spitzmaul G. Bouzat C. Neuropharmacol. 2003 ; 45: 964-976Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Le système de perfusion permet un échange rapide (0,1-1 ms) de la solution baignant le patch. Une série d'applications de solution extracellulaire contenant de l'ACh, du lévamisole ou les deux médicaments ont été appliquées sur le patch pendant 150 ms. Les courants macroscopiques ont été filtrés à 5 kHz, numérisés à 20 kHz et stockés sur le disque dur. L'analyse des données a été effectuée à l'aide du logiciel IgorPro (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR). Le courant moyen de l'ensemble a été calculé pour 5 à 10 traces de courant individuelles. Les courants moyens étaient généralement ajustés par une seule fonction exponentielle : I(t) = I0 exp(–t/τd) + I∞ où I0 et I∞ sont les valeurs de courant de crête et d'état stable, respectivement, et τd est la constante de temps de décroissance qui mesure la décroissance du courant due à la désensibilisation. Les enregistrements actuels ont été alignés les uns avec les autres au point où le courant a atteint 50 % de son niveau maximal. Courants à canal unique activés par le lévamisole-Lévamisole est un agoniste complet du muscle nématode AChR (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996 ; 113 : S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). Dans la présente étude, nous avons évalué si ce médicament anthelminthique agit également sur les AChR musculaires des mammifères. À cette fin, nous avons d'abord enregistré des canaux uniques à partir de cellules exprimant les AChR musculaires adultes (Fig. 1). Comme le montre cette figure, le lévamisole est capable d'activer les AChR des mammifères. Cependant, les ouvertures des canaux sont significativement plus brèves que celles activées par le neurotransmetteur endogène ACh. Les distributions de temps ouvert des AChR activées par le lévamisole de 1 μm peuvent être bien ajustées par un composant principal de 220 ± 20 μs (surface relative >0,7) (Fig. 1). La durée du composant ouvert principal est 4 fois plus courte que celle observée à 1 μm ACh (860 ± 80 μs, Fig. 1) (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994 ; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo A.M. Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998 ; 54: 146-153Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). L'augmentation de la concentration de lévamisole de 1 à 300 μm ne produit pas le regroupement typique observé avec les agonistes complets, tels que l'ACh. À des concentrations d'ACh supérieures à 10 μm, les AChR de type sauvage s'ouvrent en grappes d'épisodes d'activation bien définis (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) (Fig. 1). Chaque épisode d'activation commence par la transition d'un seul récepteur de l'état désensibilisé à l'état activable et se termine par le retour à l'état désensibilisé. A 300 μm ACh, la probabilité d'ouverture de canal au sein d'un cluster est ∼1 (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar ; Fig. 1). En revanche, lorsque les AChR sont activées par le lévamisole, même à des concentrations aussi élevées que 300 μm, des grappes ne sont pas observées (Fig. 1). Ces résultats suggèrent que le lévamisole ouvre les AChR des mammifères avec une plus grande latence et les ferme plus rapidement que l'ACh. L'augmentation de la concentration de lévamisole de 1 à 300 μm entraîne une réduction significative des durées d'ouverture. Les histogrammes de temps ouvert des AChR activés par le lévamisole à 300 μm peuvent être ajustés par une seule exponentielle avec un temps d'ouverture moyen de 80 ± 9 μs (Fig. 1). Une telle diminution dépendante de la concentration du temps ouvert moyen indique qu'en plus de sa capacité à activer les AChR des mammifères, le lévamisole peut agir comme un bloqueur des canaux ouverts (voir ci-dessous). Courants macroscopiques activés par le lévamisole - Pour évaluer l'efficacité du lévamisole dans l'activation des AChR de mammifères, nous avons enregistré des courants macroscopiques provenant de plaques extérieures rapidement perfusées avec du lévamisole. La figure 2 montre les courants d'ensemble obtenus à partir d'un seul patch extérieur exposé à de brèves applications de 100 μm ACh (témoin) et de 100 μm lévamisole. Dans les données de contrôle, le courant atteint le pic après 0,1-1 ms, puis se désintègre avec une constante de temps (τd) d'environ 20–30 ms en raison de la désensibilisation (Fig. 2) (20 Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001 ; 60: 235-243Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Le courant de crête n'est que d'environ 3% lorsque le même patch est exposé à 100 μm de lévamisole. De plus, dans de nombreux patchs, seuls des canaux uniques ont été observés après la perfusion de lévamisole. Ces résultats confirment la faible efficacité du médicament pour activer les AChR des mammifères. Étant donné que les expériences d'enregistrement à canal unique suggèrent que le lévamisole peut également bloquer les AChR (Fig. 1), nous avons étudié son action en tant que bloqueur de canal en l'absence et en présence d'ACh. L'augmentation de la concentration de lévamisole déplace systématiquement vers des durées plus brèves les distributions de temps ouvert des canaux AChR activés soit par 1 μm ACh (Fig. 3) soit par le lévamisole (Fig. 1). Nous avons utilisé le modèle de blocage linéaire classique pour décrire l'action du lévamisole en tant que bloqueur à canal ouvert, comme indiqué dans le schéma 2, où C indique fermé, O indique ouvert et OB indique des états bloqués. En accord avec le schéma 2, une relation linéaire entre l'inverse du temps ouvert moyen et la concentration de lévamisole ([B]) est observée (Fig. 4a). La valeur calculée pour la constante de vitesse vers l'avant de la réaction de blocage (k+b dans le schéma 2), donnée par la pente de la courbe, est de 30 × 106 et 25 × 106m-1 s–1 pour les canaux activés par l'ACh ou le lévamisole. Ainsi, les AChR activées par l'ACh ou le lévamisole sont bloquées par le lévamisole à un taux similaire. Le taux de fermeture apparent, calculé à partir de l'interception avec l'axe y, est de 5600 s–1 pour les AChR activées par le lévamisole et de 1600 s–1 pour les canaux activés par l'ACh. Cette valeur est en accord avec le taux de fermeture des canaux activés par ACh calculé par analyse cinétique (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002 ; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar).Fig. 4La caractérisation du blocage du lévamisole. a, les canaux AChR ont été enregistrés en l'absence (•) et la présence (○) de 1 μm ACh plus lévamisole à différentes concentrations finales. Les temps d'ouverture moyens ont été obtenus à partir des histogrammes de temps d'ouverture correspondants. Les données sont ajustées par l'équation 1/temps ouvert moyen = α + k+b [lévamisole], où k+b est le taux d'association du lévamisole pour le bloc de canal, et α est le taux de fermeture de canal apparent. Les données sont présentées comme une moyenne ± s.d. de 3 à 5 patchs. b, les courants AChR ont été enregistrés en présence de 1 μm ACh plus lévamisole. Le temps moyen bloqué (•) et sa surface relative (○) ont été obtenus à partir des histogrammes de temps fermés correspondants. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.d. de 3 à 5 enregistrements différents pour chaque condition. Potentiel membranaire, –70 mV. c, relation entre le temps moyen de blocage et le potentiel membranaire. Concentration de lévamisole, 50 μm. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.d. de 3 à 5 patchs. d, courants de perfusion rapides activés par 1 mm ACh (contrôle) seul et avec 100 μm de lévamisole (+ lévamisole). Les courants ont été enregistrés à –70 mV (courants descendants) et +70 mV (courants ascendants). Chaque courant représente la moyenne de 5–10 enregistrements. View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) Pour analyser le blocage par le lévamisole, nous avons étudié les distributions temporelles fermées des AChR activées par 1 μm ACh en présence de lévamisole. En son absence, les histogrammes temporels fermés correspondant à des canaux activés par l'ACh de 1 μm montrent une composante principale dont la durée dépend du nombre de canaux dans le patch (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000 ; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) (Fig. 3). La présence de lévamisole modifie de manière significative les distributions temporelles fermées des canaux activés par l'ACh, et une nouvelle composante fermée d'environ 175 μs est systématiquement observée (Fig. 3). La durée de ce composant ne change pas avec la concentration de lévamisole, mais sa surface augmente en fonction de sa concentration (Fig. 4b). On peut donc supposer que cette composante fermée correspond au blocage par le lévamisole des canaux activés par l'ACh (1/k–b dans le schéma 2). À partir de la durée de cette composante fermée (1/k–b), une valeur de 5700 s–1 est obtenue pour k-b. Ainsi, la constante de dissociation apparente pour le processus de blocage, KB = k–b/k+b, est de 190 μm à un potentiel de membrane de –70 mV. À des concentrations de lévamisole supérieures à 100 μm, la zone bloquée n'augmente pas en fonction de la concentration. Les valeurs pour les composants fermés et les surfaces relatives sont 175 ± 12 μs et 0,32 ± 0,03, et 220 ± 15, et 0,33 ± 0,08 μs pour le lévamisole de 100 et 300 μm, respectivement. Par conséquent, à des concentrations plus élevées, le mécanisme de bloc de canal s'écarte du schéma 2. La durée des périodes bloquées augmente avec les potentiels de membrane négatifs plus élevés, ce qui indique que le processus de déblocage dépend de la tension (Fig. 4c). La dépendance en tension de l'effet est confirmée par des enregistrements de patchs extérieurs (Fig. 4d). Aux potentiels membranaires positifs, le lévamisole de 100 μm n'affecte pas la constante de décroissance des courants provoqués par 1 mm ACh, et les données peuvent être ajustées par une seule décroissance exponentielle similaire au contrôle (22,5 ms). En revanche, à –70 mV, une décroissance rapide initiale précède la désensibilisation. Ce composant rapide (environ 0,5 ms) est dû au blocage du canal ouvert. La constante de temps de décroissance lente, qui correspond à la désensibilisation, est de 19,4 ± 1,8 ms. Le courant de crête n'est pas affecté, ce qui suggère qu'au rapport des concentrations utilisées, le lévamisole ne peut pas rivaliser avec l'ACh pour l'activation du canal. En bref, la caractérisation du blocage indique que le lévamisole agit comme un bloqueur typique des canaux ouverts à des concentrations inférieures à 100 μm. La comparaison des séquences révèle des résidus clés qui sont conservés différemment entre les sous-unités α des muscles des mammifères et des nématodes (Fig. 5). Pour identifier si ces résidus sont impliqués dans le comportement différentiel des médicaments anthelminthiques au niveau des parasites et des muscles des mammifères, nous les avons remplacés par les résidus équivalents chez les nématodes, les cellules cotransfectées avec les sous-unités mutantes α et non-α de type sauvage, et nous avons évalué l'activité des canaux provoquée par le lévamisole. L'efficacité du lévamisole pour activer les AChR des mammifères est considérablement augmentée lorsque le résidu αGly-153 est remplacé par un acide glutamique. Comme le montre la Fig. 6, l'activité du canal apparaît maintenant dans des grappes facilement reconnaissables à 50 μm de lévamisole. En revanche, aucun changement n'est observé dans l'activation par le lévamisole (1–100 μm) des AChR portant soit les mutations αD152S, αS154N, soit l'insertion d'une proline après αTyr-190 (α191insP).Fig. 6Activation des AChR mutantes par le lévamisole. Les canaux activés par le lévamisole de 50 μm ont été enregistrés à partir de cellules HEK exprimant des AChR contenant des sous-unités de type sauvage et mutantes αD152S, αG153E, αS154N et α191insP. À gauche, les courants sont affichés à une bande passante de 9 kHz avec des ouvertures de canal sous forme de déflexions vers le haut. Potentiel de membrane, –70 mV. Histogrammes temporels droits et fermés des AChR portant la sous-unité mutante spécifiée. Les données sont représentatives de 4 à 6 enregistrements pour chaque condition. Voir la grande image Figure ViewerDownload (PPT) Les grappes de αG153E AChR peuvent être identifiées à des concentrations supérieures à 10 μm. Le regroupement des événements d'ouverture s'accompagne de changements importants dans les histogrammes temporels fermés. La composante principale des distributions temporelles fermées, qui correspond aux fermetures à l'intérieur des grappes, est déplacée vers des durées plus brèves en fonction de la concentration de lévamisole (Fig. 7). Pour mettre en évidence les conséquences mécanistiques de la présence d'un acide glutamique à α153, nous avons enregistré les canaux activés par une gamme de concentrations de lévamisole (0,1 nm à 300 μm) et analysé l'activité des ouvertures de canaux uniques dans les grappes. En parallèle, nous avons comparé la cinétique d'activation par l'agoniste complet ACh. Lorsqu'on l'examine en détail, on peut observer que les grappes de αG153E activées par l'ACh ou le lévamisole ne sont pas homogènes, ce qui indique que ce récepteur mutant s'active dans des modes cinétiques distincts (Fig. 8). La distribution des valeurs de Popen a montré deux composantes différentes (voir « Procédures expérimentales »). Nous avons donc classé les grappes comme appartenant à deux modes de déclenchement principaux : un mode HPopen et un mode LPopen. À toutes les concentrations d'agonistes, le mode HPopen était constitué d'ouvertures significativement plus longues et de fermetures au sein de grappes plus brèves que celles du mode LPopen (Tableau I). Sur la base des distributions Popen, nous avons sélectionné les grappes correspondant à chaque mode et les avons analysées en fonction de la concentration en agonistes (Tableau I et Fig. 8).Table IChannel properties of αG153E mutant AChRs activated by ACh or levamisoleKinetic modeAChLevamisoleτoτcPopenμmmsHPopen0.00011.560.10.930.011.71 ± 0.240.08 ± 0.0070.98 ± 0.0090.11.78 ± 0.050.07 ± 0.0050.96 ± 0.002100.380.320.52500.260.320.451000.210.260.460.012.40 ± 0.200.05 ± 0.0020.98 ± 0.00113.20 ± 0.760.05 ± 0.0080.98 ± 0.002104.30 ± 0.670.05 ± 0.0030.98 ± 0.002502.70 ± 0.660.05 ± 0.0140.97 ± 0.0091002.80 ± 0.570.04 ± 0.0080.97 ± 0.005LPopen0.010.43 ± 0.07NDND10.31 ± 0.10NDND100.23 ± 0.0717.00 ± 6.500.019 ± 0.008500.19 ± 0.0210.60 ± 1.900.027 ± 0.0021.16000 ± 0.0258 ± 0.800.037 ± 0.0043.08 ± 0.0053.000 ± 0.0005LPopen0.010.95 ± 0.0010.1ND 0.31 ± 0.150.41 ± 0.050.21 ± 0.0250.81 ± 0.03.00 ± 0.050.21 ± 0.050.25 ± 0.050.2001 ± 0.020.85 ± 0.020.25 ± 0.020.25 ± 0.020.25 ± 0.020.25 ± 0.020.2250.28 ± 0.050.2250.22.70 ± 0.050.25 ± 0.050.22.70 ± 0.050.22.70 ± 0.020.22.70 ± 0.020.25 ± 0.020.25 ± 0.020.25 ± 0.050.25 ± 0.08 ± 0.050.22.22.25 ± 0.050.22.25 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.050.22.25 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.050.22.22.25 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.050.22.22.25 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.050.22.48 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.150.22.48 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.02.48 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.0 8). Le reste des ouvertures apparaissent comme des événements isolés. Le Popen calculé pour ces grappes est d'environ 1 à 1 nm de l'un ou l'autre des agonistes. Plus intéressant encore, il n'y a pas de différences significatives dans les propriétés entre les clusters activés par l'ACh ou le lévamisole (Fig. 8 et Tableau I). Par conséquent, à de faibles concentrations d'agonistes, l'activation du lévamisole de l'AChR αG153E semble être cinétiquement indiscernable de l'activation de l'ACh. Des grappes du mode HPopen sont également observées à des concentrations plus élevées des deux agonistes. Cependant, la durée moyenne du canal ainsi que le Popen diminuent à des concentrations plus élevées de lévamisole en raison du blocage du canal (Tableau I). Clusters à faible popen - Comme le concentré agonisteTranslated Description (Spanish)
El levamisol es un agente antihelmíntico que ejerce su efecto terapéutico al actuar como un agonista completo del receptor nicotínico (AChR) del músculo nematodo. Su acción en el músculo mamífero AChR no se ha dilucidado hasta la fecha a pesar de su amplio uso como antihelmíntico en humanos y ganado. Mediante registros de corriente de un solo canal y macroscópicos, investigamos la interacción del levamisol con el músculo de mamífero AChR. El levamisol activa los AChR de mamíferos. Sin embargo, las aberturas de un solo canal son más breves que las activadas por la acetilcolina (ACh) y no aparecen en grupos a altas concentraciones. La corriente máxima inducida por el levamisol es aproximadamente el 3% de la activada por ACh. Por lo tanto, el antihelmíntico actúa como un agonista débil del AChR de mamíferos. Levamisol también produce bloqueo de canal abierto de la AChR. La afinidad aparente por el bloqueo (190 μm a –70 mV) es similar a la del nematodo AChR, lo que sugiere que las diferencias en la cinética de activación del canal rigen la diferente sensibilidad de los nematodos y el músculo de los mamíferos a los antihelmínticos. Para identificar la base estructural de esta sensibilidad diferente, realizamos mutagénesis dirigida a residuos en la subunidad α que difieren entre vertebrados y nematodos. El reemplazo de la αGly-153 conservada con el ácido glutámico homólogo del nematodo AChR aumenta significativamente la eficacia del levamisol para activar los canales. La actividad del canal tiene lugar en grupos que tienen dos modos cinéticos diferentes. La cinética del modo de alta probabilidad abierta es casi idéntica cuando el agonista es ACh o levamisol. Se concluye que αGly-153 está implicado en la baja eficacia del levamisol para activar los AChR musculares de los mamíferos. El levamisol es un agente antihelmíntico que ejerce su efecto terapéutico al actuar como un agonista completo del receptor nicotínico (AChR) del músculo nematodo. Su acción en el músculo mamífero AChR no se ha dilucidado hasta la fecha a pesar de su amplio uso como antihelmíntico en humanos y ganado. Mediante registros de corriente de un solo canal y macroscópicos, investigamos la interacción del levamisol con el músculo de mamífero AChR. El levamisol activa los AChR de mamíferos. Sin embargo, las aberturas de un solo canal son más breves que las activadas por la acetilcolina (ACh) y no aparecen en grupos a altas concentraciones. La corriente máxima inducida por el levamisol es aproximadamente el 3% de la activada por ACh. Por lo tanto, el antihelmíntico actúa como un agonista débil del AChR de mamíferos. Levamisol también produce bloqueo de canal abierto de la AChR. La afinidad aparente por el bloqueo (190 μm a –70 mV) es similar a la del nematodo AChR, lo que sugiere que las diferencias en la cinética de activación del canal rigen la diferente sensibilidad de los nematodos y el músculo de los mamíferos a los antihelmínticos. Para identificar la base estructural de esta sensibilidad diferente, realizamos mutagénesis dirigida a residuos en la subunidad α que difieren entre vertebrados y nematodos. El reemplazo de la αGly-153 conservada con el ácido glutámico homólogo del nematodo AChR aumenta significativamente la eficacia del levamisol para activar los canales. La actividad del canal tiene lugar en grupos que tienen dos modos cinéticos diferentes. La cinética del modo de alta probabilidad abierta es casi idéntica cuando el agonista es ACh o levamisol. Se concluye que αGly-153 está implicado en la baja eficacia del levamisol para activar los AChR musculares de los mamíferos. En la unión neuromuscular, acetilcolina (ACh) 1Las abreviaturas utilizadas son: AChR, receptor nicotínico de acetilcolina; ACh, acetilcolina; Popen, probabilidad de canal abierto; células HEK, células renales embrionarias humanas. media la neurotransmisión rápida mediante la activación de los receptores nicotínicos (AChR). Los AChR en el músculo nematodo son objetivos para la quimioterapia antihelmíntica. El levamisol y el pirantel son dos antihelmínticos muy utilizados. Al unirse a la AChR conducen a una despolarización del músculo somático de los nematodos. La eficacia de estos fármacos se basa en su capacidad para actuar como agonistas completos de los AChR en los nematodos (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). Las mediciones de la contractilidad y el potencial de membrana han demostrado que el músculo axial de los nematodos es 10–100 veces más sensible a la acción aguda del pirantel y el levamisol que el músculo de la rata (2Atchison W.D. Geary T.G. Manning B. VandeWaa E.A. Thompson D.P. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992; 112: 133-143Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar). Las bases moleculares de esta selectividad aún no se han dilucidado. La cinética de activación de los AChR de nematodos por levamisol se ha estudiado en varias preparaciones de músculo parasitario (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar, 3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993; 108: 170-178Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar), pero su acción sobre los AChR musculares de mamíferos no se ha descrito hasta la fecha. Los efectos del levamisol en los AChR neuronales humanos α3β2 y α3β4 se han estudiado recientemente (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003; 471: 9-20 Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar) con el método de fijación de voltaje. Se demostró que el levamisol se comporta como un agonista parcial débil, un modulador alostérico y un bloqueador de canales abiertos de los AChR neuronales (4Levandoski M.M. Piket B. Chang J. Eur. J. Pharmacol. 2003; 471: 9-20Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar). ACh es responsable de la transmisión neuromuscular en nematodos (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). En el músculo Caenorhabditis elegans, los AChR activados por levamisol se componen de la subunidad unc-38, que codifica una subunidad α, y lev-1 y unc-29, que codifican subunidades no α (5Fleming J.T. Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997; 17: 5843-5857 Crossref PubMed Google Scholar). Los estudios de expresión en ovocitos de Xenopus han demostrado que las subunidades unc-38 y unc-29 son necesarias para la función de AChR (5Fleming J.T. Squire M.D. Barnes T.M. Tornoe C. Matsuda K. Ahnn J. Fire A. Sulston J.E. Barnard E.A. Sattelle D.B. Lewis J.A. J. Neurosci. 1997; 17: 5843-5857 Crossref PubMed Google Scholar). Ambas subunidades son necesarias para la expresión de receptores sensibles al levamisol en los músculos de la pared corporal de estos nematodos (6Richmond J.E. Jorgensen E.M. Nat. Neurosci. 1999; 2: 791-797Crossref PubMed Scopus (356) Google Scholar). Se han clonado otras subunidades α de nematodos a partir de los nematodos parásitos Trichostrongylus colubriformis (7Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Li Q. Gene (Amst.). 1996; 182: 97-100 Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar), Haemonchus conturtus (8Hoekstra R. Visser A. Wiley L.J. Weiss A.S. Sangster N.C. Roos M.H. Mol. Biochem. Parasitol. 1997; 84: 79-187Crossref Scopus (46) Google Scholar) y Ascaris suum (9Le Novère N. Changeux J.P. Nucleic Acid Res. 1999; 27: 340-342Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar), que muestran una similitud del 91,6, 91 y 76% con unc-38, respectivamente. Las principales características estructurales de las subunidades AChR se conservan sorprendentemente en la filogenia desde los organismos superiores hasta el nematodo. Sin embargo, los residuos conservados diferencialmente entre los AChR de mamíferos y nematodos pueden conducir a una acción farmacológica diferencial de los antihelmínticos en los AChR. En este estudio, exploramos por primera vez la interacción del levamisol con los AChR musculares de mamíferos a niveles de un solo canal y de corriente macroscópica. Nuestros resultados revelan que el levamisol muestra una eficacia extremadamente baja para la activación del canal. A altas concentraciones de levamisol, el bloqueo del canal también contribuye a mantener una baja probabilidad de apertura del canal. Por el contrario, se ha demostrado que el levamisol actúa como un potente agonista de diferentes AChR musculares de nematodos (3Robertson S.J. Martin R.J. Br. J. Pharmacol. 1993; 108: 170-178Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 10Lewis J.A. Wu C.H. Levine J.H. Berg H. Neuroscience. 1980; 5: 967-989 Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar, 11Harrow I.D. Gration K.F. Pestic. Sci. 1985; 16: 662-672Crossref Scopus (99) Google Scholar, 12Martin R.J. Pennington A.J. Duittoz A.H. Robertson S. Kusel J.R. Parasitology. 1991; 102: 41-58 Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar). Por lo tanto, este compuesto antihelmíntico explota terapéuticamente las diferencias al activar selectivamente el AChR del parásito y no el del huésped. Para identificar los residuos involucrados en esta diferente selectividad, combinamos la mutagénesis dirigida al sitio en residuos conservados diferencialmente entre las subunidades α musculares de nematodos y vertebrados, y evaluamos los cambios en la activación del levamisol. Nuestros resultados revelan que el ácido glutámico en la posición 153, que está altamente conservado en todas las subunidades α de nematodos clonadas hasta la fecha, puede estar involucrado en la potente activación de los AChR de nematodos por levamisol. La elucidación de la base molecular de la activación antihelmíntica de los AChR contribuirá en gran medida al desarrollo de terapias más selectivas contra los parásitos y a la comprensión de cómo los parásitos desarrollan resistencia a los antihelmínticos. Además, señala los determinantes de la función. La mutagénesis dirigida al sitio y la expresión de células AChR-HEK293 se transfectaron con ADNc de ratón α (de tipo salvaje o mutante), β, δ y "utilizando precipitación con fosfato de calcio en una relación de subunidades de 2:1:1: 1 para α: β:δ:", respectivamente, principalmente como se describió anteriormente (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo A.M. Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998; 54: 146-153 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). También se incluyó un plásmido que codifica la proteína fluorescente verde (pGreen lantern) para los registros para permitir la identificación de las células transfectadas bajo la óptica de fluorescencia. Las subunidades mutantes se construyeron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange™ (Stratagene). El mapeo de restricción y la secuenciación de ADN confirmaron todas las construcciones. Las células se utilizaron para los registros de pinzamiento zonal 48 h después de la transfección. Los registros de pinza de parche y los registros de análisis cinético se obtuvieron en la configuración unida a la célula (15Hamill O.P. Marty A. Neher E. Sakmann B. Sigworth F.J. Pfluegers Arch. 1981; 391: 85-100 Crossref PubMed Scopus (15149) Google Scholar) a 20 °C (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar). Las soluciones de baño y pipeta contenían 142 mm de KCl, 5,4 mm de NaCl, 1,8 mm de CaCl2, 1,7 mm de MgCl2 y 10 mm de HEPES (pH 7,4). Se añadieron acetilcolina (ACh), levamisol (Sigma) o ambos fármacos a la solución de pipeta. Las corrientes de un solo canal se registraron utilizando un amplificador de patch clamp Axopatch 200 B (Axon Instruments, Inc., CA), digitalizado a intervalos de 5 μs con la interfaz PCI-611E (National Instruments, Austin, TX), grabado en el disco duro de un ordenador utilizando el programa Acquire (Bruxton Corporation, Seattle, WA), y detectado por el criterio de umbral de media amplitud utilizando el programa TAC 4.0.10 (Bruxton Corporation, Seattle, WA) a un ancho de banda final de 10 kHz. Los histogramas de tiempo abierto y cerrado se trazaron utilizando una abscisa logarítmica y una ordenada de raíz cuadrada y se ajustaron a la suma de exponenciales por probabilidad máxima utilizando el programa TACFit (Bruxton Corp., Seattle, WA). Los grupos se identificaron como una serie de eventos estrechamente espaciados precedidos y seguidos por intervalos cerrados más largos que una duración especificada (tcrit); esta duración se tomó como el punto de intersección del componente de tiempo cerrado predominante y el sucesivo en el histograma de tiempo cerrado. Se descartaron los clústeres que mostraban dobles aberturas. Para cada registro, los grupos se seleccionaron en función de su distribución de probabilidad abierta (Popen), duración media abierta y duración media cerrada (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M.J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar). Las distribuciones Popen del mutante αG153E AChR muestran dos componentes claros, que se definieron como modo Popen alto (HPopen) y Popen bajo (LPopen). Los grupos de cada modo se seleccionaron primero para permitir un análisis cinético separado para cada modo. Para el análisis, solo usamos clústeres que mostraban solo un modo de compuerta. Para el modo Popen alto activado por ACh y levamisol, el análisis cinético se restringió a grupos, cada uno reflejando la actividad de un solo AChR (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997; 109: 757-766Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M.J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar). Los intervalos abiertos y cerrados resultantes de los grupos seleccionados se analizaron de acuerdo con esquemas cinéticos utilizando un algoritmo de probabilidad completa basado en intervalos (www.qub.buffalo.edu) (QuB suite, State University of New York, Buffalo). El tiempo muerto era típicamente de 30 μs. Las funciones de densidad de probabilidad de las duraciones abierta y cerrada se calcularon a partir de las constantes de velocidad ajustadas y el tiempo muerto de la instrumentación y se superpusieron en el histograma de tiempo de permanencia experimental como se describe por Qin et al. (19Qin F. Auerbach A. Sachs F. Biophys. J. 1996; 70: 264-280Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (372) Google Scholar). Las tasas calculadas se aceptaron solo si las funciones de densidad de probabilidad resultantes se ajustaban correctamente a los histogramas experimentales de duración abierta y cerrada. El otro enfoque se aplicó al modo de activación de Popen bajo del αG153E AChR y a los AChR de tipo salvaje activados por levamisol, en los que se observaron grupos menos claros o nulos. Analizamos el comportamiento de las ráfagas de actividad de un solo canal provocadas por bajas concentraciones de agonistas, donde no se pueden ver grupos y el bloqueo es insignificante, sobre la base del Esquema de activación clásico 1, donde dos agonistas (A) se unen al receptor (R) en estado de reposo con tasas de asociación k+1 y k+2 y se disocian con tasas k–1 y k–2. Los AChR ocupados por dos moléculas agonistas se abren con tasa β y se cierran con tasa α. Las ráfagas a bajas concentraciones de agonista contienen información sobre el estado abierto y el estado cerrado inmediatamente adyacente (16Wang H.L. Auerbach A. Bren N. Ohno K. Engel A.G. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 1997; 109: 757-766 Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). Por lo tanto, las estimaciones de β, α y k–2 se pueden obtener a partir de la duración media del componente más breve del histograma de tiempo cerrado (τc), su área relativa (Aτc) y la duración media de la ráfaga (τb) de la siguiente manera: τc = 1/(β + k–2); Aτc = β/(β + k–2); τb = (1 + β/k–2) (1/α). Grabaciones actuales macroscópicas: para las grabaciones de parches externos, la solución de pipeta contenía 140 mm de KCl, 5 mm de EGTA, 5 mm de MgCl2 y 10 mm de HEPES (pH 7,3). La solución extracelular contenía 150 mm de NaCl, 5,6 mm de KCl, 1,8 mm de CaCl2, 1 mm de MgCl2 y 10 mm de HEPES (pH 7,3). El parche se extirpó en esta configuración y se movió a su posición en el flujo de salida de un sistema de perfusión como se describió anteriormente (20Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001; 60: 235-243Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 21Gumilar F. Arias H.R. Spitzmaul G. Bouzat C. Neuropharmacol. 2003; 45: 964-976 Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). El sistema de perfusión permite un intercambio rápido (0,1-1 ms) de la solución que baña el parche. Se aplicó una serie de aplicaciones de solución extracelular que contenía ACh, levamisol o ambos fármacos al parche durante 150 ms. Las corrientes macroscópicas se filtraron a 5 kHz, se digitalizaron a 20 kHz y se almacenaron en el disco duro. El análisis de datos se realizó utilizando el software IgorPro (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR). La corriente media del conjunto se calculó para 5–10 trazas de corriente individuales. Las corrientes medias generalmente se ajustaron mediante una sola función exponencial: I(t) = I0 exp(–t/τd) + I∞ donde I0 e I∞ son los valores de corriente pico y de estado estacionario, respectivamente, y τd es la constante de tiempo de decaimiento que mide el decaimiento de corriente debido a la desensibilización. Los registros actuales se alinearon entre sí en el punto donde la corriente alcanzó el 50% de su nivel máximo. Corrientes de un solo canal activadas por levamisol: el levamisol es un agonista completo del músculo nematodo AChR (1Martin R.J. Valkanov M.A. Dale V.M. Robertson A.P. Murray I. Parasitology. 1996; 113: S137-S156Crossref PubMed Google Scholar). En el presente estudio, evaluamos si este fármaco antihelmíntico también actúa sobre los AChR musculares de mamíferos. Con este fin, primero registramos canales individuales de células que expresan AChR de músculo adulto (Fig. 1). Como se muestra en esta figura, el levamisol es capaz de activar los AChR de mamíferos. Sin embargo, las aberturas de los canales son significativamente más breves que las activadas por el neurotransmisor endógeno ACh. Las distribuciones de tiempo abierto de AChR activados por levamisol de 1 μm pueden ser bien ajustadas por un componente principal de 220 ± 20 μs (área relativa >0.7) (Fig. 1). La duración del componente abierto principal es 4 veces más breve que la observada a 1 μm ACh (860 ± 80 μs, Fig. 1) (13Bouzat C. Bren N. Sine S. Neuron. 1994; 13: 1395-1402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar, 14Bouzat C. Roccamo A.M. Garbus I. Barrantes F.J. Mol. Pharmacol. 1998; 54: 146-153 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). El aumento de la concentración de levamisol de 1 a 300 μm no produce el agrupamiento típico observado con agonistas completos, como ACh. A concentraciones de ACh superiores a 10 μm, los AChR de tipo salvaje se abren en grupos de episodios de activación bien definidos (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) (Fig. 1). Cada episodio de activación comienza con la transición de un solo receptor del estado desensibilizado al estado activable y termina volviendo al estado desensibilizado. A 300 μm ACh, la probabilidad de apertura del canal dentro de un grupo es ∼1 (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar; Fig. 1). Por el contrario, cuando los AChR son activados por levamisol, incluso a concentraciones tan altas como 300 μm, no se observan grupos (Fig. 1). Estos resultados sugieren que el levamisol abre los AChR de mamíferos con mayor latencia y los cierra más rápido que los ACh. El aumento de la concentración de levamisol de 1 a 300 μm conduce a una reducción significativa de las duraciones abiertas. Los histogramas de tiempo abierto de los AChR activados por levamisol de 300 μm pueden ajustarse mediante una exponencial única con un tiempo medio de apertura de 80 ± 9 μs (Fig. 1). Tal disminución dependiente de la concentración en el tiempo abierto medio indica que, además de su capacidad de activar los AChR de mamíferos, el levamisol puede actuar como un bloqueador de canales abiertos (véase más adelante). Corrientes macroscópicas activadas por levamisol: para evaluar la eficacia del levamisol en la activación de los AChR de mamíferos, registramos corrientes macroscópicas de parches externos perfundidos rápidamente con levamisol. La Fig. 2 muestra las corrientes de conjunto obtenidas de un solo parche exterior expuesto a aplicaciones breves de 100 μm ACh (control) y 100 μm levamisol. En los datos de control, la corriente alcanza el pico después de 0.1–1 ms y luego decae con una constante de tiempo (τd) de aproximadamente 20–30 ms debido a la desensibilización (Fig. 2) (20 Spitzmaul G. Dilger J.P. Bouzat C. Mol. Pharmacol. 2001; 60: 235-243Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). La corriente máxima es de solo alrededor del 3% cuando el mismo parche se expone a 100 μm de levamisol. Además, en muchos parches solo se observaron canales individuales después de la perfusión con levamisol. Estos resultados confirman la baja eficacia del fármaco para activar los AChR de mamíferos. Dado que los experimentos de registro de un solo canal sugieren que el levamisol también puede bloquear los AChR (Fig. 1), estudiamos su acción como bloqueador de canales en ausencia y presencia de ACh. El aumento de la concentración de levamisol desplaza sistemáticamente a duraciones más breves las distribuciones de tiempo abierto de los canales AChR activados ya sea por 1 μm ACh (Fig. 3) o por levamisol (Fig. 1). Utilizamos el modelo clásico de bloqueo lineal para describir la acción del levamisol como bloqueador de canales abiertos como se muestra en el Esquema 2, donde C indica cerrado, O indica abierto y OB indica estados bloqueados. De acuerdo con el Esquema 2, se observa una relación lineal entre el recíproco del tiempo abierto medio y la concentración de levamisol ([B]) (Fig. 4a). El valor calculado para la constante de velocidad directa de la reacción de bloqueo (k+b en el Esquema 2), dada por la pendiente de la curva, es 30 × 106 y 25 × 106m-1 s-1 para canales activados por ACh o levamisol. Por lo tanto, los AChR activados por ACh o levamisol son bloqueados por levamisol a una velocidad similar. La velocidad de cierre aparente, calculada a partir de la intersección con el eje y, es de 5600 s–1 para los AChR activados por levamisol y de 1600 s–1 para los canales activados por ACh. Este valor concuerda con la tasa de cierre de canales activados por ACh calculada mediante análisis cinético (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M.J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 18Bouzat C. Gumilar F. del Carmen Esandi M. Sine S.M. Biophys. J. 2002; 82: 1920-1929Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar).Fig. 4Caracterización del bloqueo de levamisol. a, Se registraron canales AChR en ausencia (•) y presencia (○) de 1 μm ACh más levamisol a diferentes concentraciones finales. Los tiempos de apertura medios se obtuvieron a partir de los histogramas de tiempo de apertura correspondientes. Los datos se ajustan mediante la ecuación 1/tiempo medio de apertura = α + k+b [levamisol], donde k+b es la tasa de asociación de levamisol para el bloqueo de canales, y α es la tasa aparente de cierre de canales. Los datos se muestran como la media ± DE de 3–5 parches. b, las corrientes de AChR se registraron en presencia de 1 μm de ACh más levamisol. El tiempo medio bloqueado (•) y su área relativa (○) se obtuvieron a partir de los correspondientes histogramas de tiempo cerrado. Los datos se muestran como la media ± DE de 3–5 registros diferentes para cada condición. Potencial de membrana, –70 mV. c, relación entre el tiempo medio bloqueado y el potencial de membrana. Concentración de levamisol, 50 μm. Los datos se muestran como la media ± DE de 3–5 parches. d, corrientes de perfusión rápida activadas por 1 mm ACh (control) solo y junto con 100 μm de levamisol (+ levamisol). Las corrientes se registraron a -70 mV (corrientes descendentes) y +70 mV (corrientes ascendentes). Cada corriente representa el promedio de 5–10 registros.Ver Figura de Imagen Grande VisorDescarga (PPT) Para analizar el bloqueo por levamisol, estudiamos las distribuciones de tiempo cerrado de AChRs activados por 1 μm ACh en presencia de levamisol. En su ausencia, los histogramas de tiempo cerrado correspondientes a canales activados por ACh de 1 μm muestran un componente principal cuya duración depende del número de canales en el parche (17Bouzat C. Barrantes F.J. Sine S.M. J. Gen. Physiol. 2000; 115: 663-672 Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) (Fig. 3). La presencia de levamisol cambia significativamente las distribuciones de tiempo cerrado de los canales activados por ACh, y se observa sistemáticamente un nuevo componente cerrado de aproximadamente 175 μs (Fig. 3). La duración de este componente no cambia con la concentración de levamisol, pero su área aumenta en función de su concentración (Fig. 4b). Por lo tanto, es posible suponer que este componente cerrado corresponde al bloqueo por levamisol de los canales activados por ACh (1/k–b en el Esquema 2). A partir de la duración de este componente cerrado (1/k-b) se obtiene un valor de 5700 s–1 para k–b. Por lo tanto, la constante de disociación aparente para el proceso de bloqueo, KB = k-b/k+b, es de 190 μm a un potencial de membrana de –70 mV. A concentraciones de levamisol superiores a 100 μm, el área bloqueada no aumenta en función de la concentración. Los valores para los componentes cerrados y las áreas relativas son 175 ± 12 μs y 0.32 ± 0.03, y 220 ± 15, y 0.33 ± 0.08 μs para 100 y 300 μm de levamisol, respectivamente. Por lo tanto, a concentraciones más altas, el mecanismo de bloqueo de canales se desvía del Esquema 2. La duración de los períodos bloqueados aumenta con los potenciales de membrana negativos más altos, lo que indica que el proceso de desbloqueo depende del voltaje (Fig. 4c). La dependencia del voltaje del efecto se confirma mediante registros de parches externos (Fig. 4d). A potenciales de membrana positivos, el levamisol de 100 μm no afecta la constante de decaimiento de las corrientes provocadas por 1 mm ACh, y los datos pueden ajustarse mediante un único decaimiento exponencial similar al del control (22,5 ms). Por el contrario, a –70 mV, una descomposición rápida inicial precede a la desensibilización. Este componente rápido (aproximadamente 0,5 ms) se debe al bloqueo del canal abierto. La constante de tiempo de decaimiento lento, que corresponde a la desensibilización, es de 19.4 ± 1.8 ms. La corriente máxima no se ve afectada, lo que sugiere que en la proporción de concentraciones que se utilizan, el levamisol no puede competir con ACh por la activación del canal. En resumen, la caracterización del bloqueo indica que el levamisol actúa como un bloqueador típico de canales abiertos en concentraciones inferiores a 100 μm. La comparación de secuencias revela residuos clave que se conservan diferencialmente entre las subunidades α musculares de mamíferos y nematodos (Fig. 5). Para identificar si estos residuos están involucrados en el comportamiento diferencial de los fármacos antihelmínticos en el músculo del parásito y del mamífero, los reemplazamos por los residuos equivalentes en nematodos, células cotransfectadas con las subunidades mutantes α y no α de tipo salvaje, y evaluamos la actividad del canal provocada por el levamisol. La eficacia del levamisol para activar los AChR de mamíferos aumenta considerablemente cuando el residuo αGly-153 se reemplaza por un ácido glutámico. Como se muestra en la Fig. 6, la actividad del canal aparece ahora en grupos fácilmente reconocibles a 50 μm de levamisol. Por el contrario, no se observan cambios en la activación por levamisol (1–100 μm) de los AChR que portan las mutaciones αD152S, αS154N o la inserción de una prolina después de αTyr-190 (α191insP).Fig. 6Activación de AChR mutantes por levamisol. Se registraron canales activados por levamisol de 50 μm de células HEK que expresan AChR que contienen subunidades de tipo salvaje y mutantes αD152S, αG153E, αS154N y α191insP. A la izquierda, las corrientes se muestran en un ancho de banda de 9 kHz con aberturas de canal como deflexiones hacia arriba. Potencial de membrana, –70 mV. Derecha, histogramas de tiempo cerrados de AChR que portan la subunidad mutante especificada. Los datos son representativos de 4–6 registros para cada condición. Ver Visualizador de figuras de imagen grande. Los grupos de descarga (PPT) de αG153E AChR se pueden identificar a concentraciones superiores a 10 μm. La agrupación de eventos de apertura se acompaña de cambios importantes en los histogramas de tiempo cerrado. El componente principal de las distribuciones de tiempo cerrado, que corresponde a los cierres dentro de los grupos, se desplaza a duraciones más breves en función de la concentración de levamisol (Fig. 7). Para descubrir las consecuencias mecanicistas de la presencia de un ácido glutámico en α153, registramos canales activados por un rango de concentraciones de levamisol (0.1 nm a 300 μm) y analizamos la actividad de las aberturas de un solo canal en grupos. En paralelo, comparamos la cinética de activación por el agonista completo ACh. Cuando se examina en detalle, se puede observar que los grupos de αG153E activados por ACh o levamisol no son homogéneos, lo que indica que este receptor mutante se activa en distintos modos cinéticos (Fig. 8). La distribución de los valores de Popen mostró dos componentes diferentes (ver "Procedimientos experimentales"). Por lo tanto, clasificamos los clústeres como pertenecientes a dos modos de compuerta principales: un modo HPopen y un modo LPopen. En todas las concentraciones de agonistas, el modo HPopen consistió en aberturas que eran significativamente más largas y cierres dentro de grupos que eran más breves que los del modo LPopen (Tabla I). Con base en las distribuciones de Popen, seleccionamos los clústeres correspondientes a cada modo y los analizamos en función de la concentración de agonista (Tabla I y Fig. 8).Table IChannel properties of αG153E mutant AChRs activated by ACh or levamisoleKinetic modeAChLevamisoleτoτcPopenμmmsHPopen0.00011.560.10.930.011.71 ± 0.240.08 ± 0.0070.98 ± 0.0090.11.78 ± 0.050.07 ± 0.0050.96 ± 0.002100.380.320.52500.260.320.451000.210.260.460.012.40 ± 0.200.05 ± 0.0020.98 ± 0.00113.20 ± 0.760.05 ± 0.0080.98 ± 0.002104.30 ± 0.670.05 ± 0.0030.98 ± 0.002502.70 ± 0.660.05 ± 0.0140.97 ± 0.0091002.80 ± 0.570.04 ± 0.0080.97 ± 0.005LPopen0.010.43 ± 0.07NDND10.31 ± 0.10NDND100.23 ± 0.0717.00 ± 6.500.019 ± 0.008500.19 ± 0.0210.60 ± 1.900.027 ± 0.0021.16 ± 0.025.08 ± 0.800.037 ± 0.0043.08 ± 0.0053.50.05 ± 0.0027.05 ± 0.0010NDNDD100.11 ± 0.11.50 ± 0.150 ± 0.150.40 ± 0.150 ± 0.150 ± 0.150 ± 0.13.203 ± 0.150 ± 0.150 ± 0.100.03 ± 0.150 ± 0.020 ± 0.120 ± 0.020 ± 0.120 ± 0.020.05 ± 0.020.25 nm (0.020.05 ± 0.020.05 ± 0.020.05 ± 0.020.08 ± 0.0020.05 ± 0.0020.08 ± 0.0020.08 ± 0.0011.08 ± 0.0011.08 ± 0.0000.08 ± 0.0000.08 ± 0.0011.00 ± 0.0000.07 ± 0.007 ± 0.0000.07 ± 0.007 ± 0.007 ± 0.0000.07 ± 0.007 ± 0.0000.07 ± 0.007 ± 0.0000.07 ± 0.007 ± 0.0000.07 ± 0.0000.07 ± 0.003 ± 0.0000.07 ± 0.0000.07 ± 0.0000.07 ± 0.003 ± 0.0000.07 ± 0.0000.07 ± 0.0000.07 ± 0.005 ± 0.005 ± 0.0000.07 ± 0.0000.00 ± 0.0000.07 ± 0.0000.00 ± 0.0000.07 ± 0.005 ± 0.003 ± 0.003 ± 0.003 ± 0.003 ± 0.003 ± 0.0000.07 ± 0.003 ± 0.0000.08 ± 0.0000.00 ± 0.003 ± 0.0000.07 ± 0.0000.00 ± 0.003 ± 0.003 ± 0.003 ± 0.0000.07 ± 0.90 ± 0.0000.00 ± 0.90 ± 1.900.0 8). El resto de las aperturas aparecen como eventos aislados. El Popen calculado para estos grupos es de aproximadamente 1 a 1 nm de cualquiera de los agonistas. Lo más interesante es que no hay diferencias significativas en las propiedades entre los grupos activados por ACh o levamisol (Fig. 8 y Tabla I). Por lo tanto, a bajas concentraciones de agonistas, la activación de levamisol del αG153E AChR parece ser cinéticamente indistinguible de la activación de ACh. Los grupos del modo HPopen también se observan a concentraciones más altas de ambos agonistas. Sin embargo, la duración media del canal, así como el Popen, disminuyen a concentraciones más altas de levamisol debido al bloqueo del canal (Tabla I). Grupos de Popen bajos: a medida que el agonista se concentraFiles
pdf.pdf
Files
(16.0 kB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:5f7b203bf0ff787f93235beef86e1e07
|
16.0 kB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- الأساس الجزيئي للحساسية التفاضلية للديدان الخيطية وعضلات الثدييات للعامل المضاد للديدان الليفاميزول
- Translated title (French)
- Base moléculaire de la sensibilité différentielle du muscle des nématodes et des mammifères à l'agent anthelminthique Levamisole
- Translated title (Spanish)
- Bases moleculares de la sensibilidad diferencial de los nematodos y el músculo de los mamíferos al agente antihelmíntico levamisol
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2004412059
- DOI
- 10.1074/jbc.m403096200
References
- https://openalex.org/W1488144458
- https://openalex.org/W1605667399
- https://openalex.org/W1788430178
- https://openalex.org/W1954391111
- https://openalex.org/W1974436521
- https://openalex.org/W1975382331
- https://openalex.org/W1982741440
- https://openalex.org/W1990594499
- https://openalex.org/W2000197813
- https://openalex.org/W2001408976
- https://openalex.org/W2009667219
- https://openalex.org/W2014629704
- https://openalex.org/W2020229027
- https://openalex.org/W2022738571
- https://openalex.org/W2032716964
- https://openalex.org/W2032733145
- https://openalex.org/W2037855135
- https://openalex.org/W2038522084
- https://openalex.org/W2046876882
- https://openalex.org/W2047563311
- https://openalex.org/W2050224291
- https://openalex.org/W2053821073
- https://openalex.org/W2069219889
- https://openalex.org/W2070788690
- https://openalex.org/W2074005920
- https://openalex.org/W2075631515
- https://openalex.org/W2080455839
- https://openalex.org/W2081307064
- https://openalex.org/W2087233406
- https://openalex.org/W2089375566
- https://openalex.org/W2093348391
- https://openalex.org/W2095890534
- https://openalex.org/W2101014022
- https://openalex.org/W2113789606
- https://openalex.org/W2118321049
- https://openalex.org/W2152806181
- https://openalex.org/W2154797753
- https://openalex.org/W2159202569
- https://openalex.org/W2341946378
- https://openalex.org/W2419512388