Published August 28, 2015
| Version v1
Publication
Open
Improved Quantification, Propagation, Purification and Storage of the Obligate Intracellular Human Pathogen Orientia tsutsugamushi
Creators
- 1. Mahidol Oxford Tropical Medicine Research Unit
- 2. Mahidol University
- 3. University of Oxford
Description
Background Scrub typhus is a leading cause of serious febrile illness in rural Southeast Asia. The causative agent, Orientia tsutsugamushi, is an obligate intracellular bacterium that is transmitted to humans by the bite of a Leptotrombidium mite. Research into the basic mechanisms of cell biology and pathogenicity of O. tsutsugamushi has lagged behind that of other important human pathogens. One reason for this is that O. tsutsugamushi is an obligate intracellular bacterium that can only be cultured in mammalian cells and that requires specific methodologies for propagation and analysis. Here, we have performed a body of work designed to improve methods for quantification, propagation, purification and long-term storage of this important but neglected human pathogen. These results will be useful to other researchers working on O. tsutsugamushi and also other obligate intracellular pathogens such as those in the Rickettsiales and Chlamydiales families. Methodology A clinical isolate of O. tsutsugamushi was grown in cultured mouse embryonic fibroblast (L929) cells. Bacterial growth was measured using an O. tsutsugamushi-specific qPCR assay. Conditions leading to improvements in viability and growth were monitored in terms of the effect on bacterial cell number after growth in cultured mammalian cells. Key results Development of a standardised growth assay to quantify bacterial replication and viability in vitro. Quantitative comparison of different DNA extraction methods. Quantification of the effect on growth of FBS concentration, daunorubicin supplementation, media composition, host cell confluence at infection and frequency of media replacement. Optimisation of bacterial purification including a comparison of host cell lysis methods, purification temperature, bacterial yield calculations and bacterial pelleting at different centrifugation speeds. Quantification of bacterial viability loss after long term storage and freezing under a range of conditions including different freezing buffers and different rates of freezing. Conclusions Here we present a standardised method for comparing the viability of O. tsutsugamushi after purification, treatment and propagation under various conditions. Taken together, we present a body of data to support improved techniques for propagation, purification and storage of this organism. This data will be useful both for improving clinical isolation rates as well as performing in vitro cell biology experiments.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
خلفية: يعد التيفوس سببًا رئيسيًا لمرض الحمى الخطير في المناطق الريفية في جنوب شرق آسيا. العامل المسبب، Orientia tsutsugamushi، هو بكتيريا ملزمة داخل الخلايا تنتقل إلى البشر عن طريق لدغة سوس Leptotrombidium. لقد تخلفت الأبحاث في الآليات الأساسية لبيولوجيا الخلايا وإمراض O. tsutsugamushi عن مسببات الأمراض البشرية المهمة الأخرى. أحد أسباب ذلك هو أن O. tsutsugamushi هو بكتيريا ملزمة داخل الخلايا لا يمكن استزراعها إلا في خلايا الثدييات والتي تتطلب منهجيات محددة للانتشار والتحليل. هنا، قمنا بمجموعة من الأعمال المصممة لتحسين طرق القياس الكمي والانتشار والتنقية والتخزين طويل الأجل لهذا الممرض البشري المهم ولكن المهمل. ستكون هذه النتائج مفيدة للباحثين الآخرين الذين يعملون على O. tsutsugamushi وأيضًا مسببات الأمراض الأخرى الملزمة داخل الخلايا مثل تلك الموجودة في عائلات Rickettsiales و Chlamydiales. المنهجية نما العزل السريري لـ O. tsutsugamushi في خلايا الأرومة الليفية الجنينية للفئران المستزرعة (L929). تم قياس النمو البكتيري باستخدام اختبار QPCR الخاص بـ O. tsutsugamushi. تم رصد الظروف التي تؤدي إلى تحسينات في الجدوى والنمو من حيث التأثير على عدد الخلايا البكتيرية بعد النمو في خلايا الثدييات المستزرعة. النتائج الرئيسية تطوير مقايسة نمو موحدة لقياس التكاثر البكتيري وقابليته للحياة في المختبر. مقارنة كمية بين طرق استخراج الحمض النووي المختلفة. القياس الكمي للتأثير على نمو تركيز FBS، مكملات الداونوروبيسين، تكوين الوسائط، التقاء الخلايا المضيفة عند العدوى وتواتر استبدال الوسائط. تحسين التنقية البكتيرية بما في ذلك مقارنة طرق تحلل الخلايا المضيفة ودرجة حرارة التنقية وحسابات العائد البكتيري والتكوير البكتيري بسرعات طرد مركزي مختلفة. القياس الكمي لفقدان الجدوى البكتيرية بعد التخزين والتجميد على المدى الطويل في ظل مجموعة من الظروف بما في ذلك مخازن التجميد المختلفة ومعدلات التجميد المختلفة. الاستنتاجات نقدم هنا طريقة موحدة لمقارنة صلاحية O. tsutsugamushi بعد التنقية والعلاج والانتشار في ظل ظروف مختلفة. ونقدم معًا مجموعة من البيانات لدعم التقنيات المحسنة لنشر هذا الكائن الحي وتنقيته وتخزينه. ستكون هذه البيانات مفيدة لكل من تحسين معدلات العزل السريري وكذلك إجراء تجارب بيولوجيا الخلايا المختبرية.Translated Description (French)
Contexte Le typhus exfoliant est l'une des principales causes de maladies fébriles graves dans les zones rurales d'Asie du Sud-Est. L'agent causal, Orientia tsutsugamushi, est une bactérie intracellulaire obligatoire qui est transmise à l'homme par la morsure d'un acarien Leptotrombidium. La recherche sur les mécanismes fondamentaux de la biologie cellulaire et de la pathogénicité de O. tsutsugamushi est à la traîne par rapport à celle d'autres agents pathogènes humains importants. L'une des raisons en est que O. tsutsugamushi est une bactérie intracellulaire obligatoire qui ne peut être cultivée que dans des cellules de mammifères et qui nécessite des méthodologies spécifiques pour la propagation et l'analyse. Ici, nous avons effectué un ensemble de travaux visant à améliorer les méthodes de quantification, de propagation, de purification et de stockage à long terme de cet agent pathogène humain important mais négligé. Ces résultats seront utiles à d'autres chercheurs travaillant sur O. tsutsugamushi et également d'autres agents pathogènes intracellulaires obligatoires tels que ceux des familles Rickettsiales et Chlamydiales. Méthodologie Un isolat clinique d'O. tsutsugamushi a été cultivé dans des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris cultivées (L929). La croissance bactérienne a été mesurée à l'aide d'un test qPCR spécifique à O. tsutsugamushi. Les conditions conduisant à des améliorations de la viabilité et de la croissance ont été suivies en termes d'effet sur le nombre de cellules bactériennes après la croissance dans des cellules de mammifères cultivées. Résultats clés Développement d'un test de croissance standardisé pour quantifier la réplication et la viabilité bactériennes in vitro. Comparaison quantitative des différentes méthodes d'extraction d'ADN. Quantification de l'effet sur la croissance de la concentration de FBS, de la supplémentation en daunorubicine, de la composition des milieux, de la confluence des cellules hôtes à l'infection et de la fréquence de remplacement des milieux. Optimisation de la purification bactérienne, y compris une comparaison des méthodes de lyse des cellules hôtes, de la température de purification, des calculs de rendement bactérien et du bouletage bactérien à différentes vitesses de centrifugation. Quantification de la perte de viabilité bactérienne après un stockage à long terme et une congélation dans diverses conditions, y compris différents tampons de congélation et différents taux de congélation. Conclusions Nous présentons ici une méthode standardisée pour comparer la viabilité de O. tsutsugamushi après purification, traitement et propagation dans diverses conditions. Ensemble, nous présentons un ensemble de données pour soutenir l'amélioration des techniques de propagation, de purification et de stockage de cet organisme. Ces données seront utiles à la fois pour améliorer les taux d'isolement clinique et pour effectuer des expériences de biologie cellulaire in vitro.Translated Description (Spanish)
Antecedentes El tifus de matorral es una de las principales causas de enfermedades febriles graves en las zonas rurales del sudeste asiático. El agente causal, Orientia tsutsugamushi, es una bacteria intracelular obligada que se transmite a los humanos por la picadura de un ácaro Leptotrombidium. La investigación sobre los mecanismos básicos de la biología celular y la patogenicidad de O. tsutsugamushi se ha quedado atrás de la de otros patógenos humanos importantes. Una razón para esto es que O. tsutsugamushi es una bacteria intracelular obligada que solo se puede cultivar en células de mamíferos y que requiere metodologías específicas para la propagación y el análisis. Aquí, hemos realizado un cuerpo de trabajo diseñado para mejorar los métodos de cuantificación, propagación, purificación y almacenamiento a largo plazo de este importante pero descuidado patógeno humano. Estos resultados serán útiles para otros investigadores que trabajan en O. tsutsugamushi y también otros patógenos intracelulares obligados como los de las familias Rickettsiales y Chlamydiales. Metodología Se cultivó un aislado clínico de O. tsutsugamushi en células cultivadas de fibroblastos embrionarios de ratón (L929). El crecimiento bacteriano se midió usando un ensayo de qPCR específico de O. tsutsugamushi. Las condiciones que conducen a mejoras en la viabilidad y el crecimiento se monitorearon en términos del efecto sobre el número de células bacterianas después del crecimiento en células de mamífero cultivadas. Resultados clave Desarrollo de un ensayo de crecimiento estandarizado para cuantificar la replicación bacteriana y la viabilidad in vitro. Comparación cuantitativa de diferentes métodos de extracción de ADN. Cuantificación del efecto sobre el crecimiento de la concentración de FBS, la suplementación con daunorrubicina, la composición de los medios, la confluencia de las células huésped en la infección y la frecuencia de reemplazo de los medios. Optimización de la purificación bacteriana que incluye una comparación de los métodos de lisis de células huésped, la temperatura de purificación, los cálculos de rendimiento bacteriano y la sedimentación bacteriana a diferentes velocidades de centrifugación. Cuantificación de la pérdida de viabilidad bacteriana después del almacenamiento a largo plazo y la congelación en una variedad de condiciones que incluyen diferentes amortiguadores de congelación y diferentes velocidades de congelación. Conclusiones Aquí presentamos un método estandarizado para comparar la viabilidad de O. tsutsugamushi después de la purificación, el tratamiento y la propagación en diversas condiciones. En conjunto, presentamos un conjunto de datos para respaldar técnicas mejoradas para la propagación, purificación y almacenamiento de este organismo. Estos datos serán útiles tanto para mejorar las tasas de aislamiento clínico como para realizar experimentos de biología celular in vitro.Files
journal.pntd.0004009&type=printable.pdf
Files
(3.6 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:64b4d594a6eee3b680279eeb1739db33
|
3.6 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تحسين القياس الكمي والانتشار والتنقية والتخزين لمسببات الأمراض البشرية داخل الخلايا الملزمة
- Translated title (French)
- Amélioration de la quantification, de la propagation, de la purification et du stockage de l'agent pathogène humain intracellulaire obligatoire Orientia tsutsugamushi
- Translated title (Spanish)
- Cuantificación, propagación, purificación y almacenamiento mejorados del patógeno humano intracelular obligado Orientia tsutsugamushi
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W1674947496
- DOI
- 10.1371/journal.pntd.0004009
References
- https://openalex.org/W107050424
- https://openalex.org/W1547430410
- https://openalex.org/W1559079979
- https://openalex.org/W1780592118
- https://openalex.org/W1834442376
- https://openalex.org/W1927777758
- https://openalex.org/W1947334845
- https://openalex.org/W1973002878
- https://openalex.org/W1981591073
- https://openalex.org/W1995583984
- https://openalex.org/W1996295543
- https://openalex.org/W1998033099
- https://openalex.org/W2004555770
- https://openalex.org/W2011152693
- https://openalex.org/W2021751029
- https://openalex.org/W2027211850
- https://openalex.org/W2043887615
- https://openalex.org/W2053946016
- https://openalex.org/W2084774582
- https://openalex.org/W2094305707
- https://openalex.org/W2108704389
- https://openalex.org/W2115627440
- https://openalex.org/W2116038472
- https://openalex.org/W2125909463
- https://openalex.org/W2128010464
- https://openalex.org/W2150906853
- https://openalex.org/W2155609746
- https://openalex.org/W2156429274
- https://openalex.org/W2188057988
- https://openalex.org/W2218304362
- https://openalex.org/W2336942569
- https://openalex.org/W2399283936