EXPRESSION, PURIFICATION AND APPLICATION OF A RECOMBINANT, MEMBRANE PERMEATING VERSION OF THE LIGHT CHAIN OF BOTULINUM TOXIN B
Creators
- 1. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza
Description
Botulinum neurotoxins (BoNTs) are valuable tools to unveil molecular mechanisms of exocytosis in neuronal and non-neuronal cells due to their peptidase activity on exocytic isoforms of SNARE proteins. They are produced by Clostridia as single-chain polypeptides that are proteolytically cleaved into light, catalytic domains covalently linked via disulfide bonds to heavy, targeting domains. This format of two subunits linked by disulfide bonds is required for the full neurotoxicity of BoNTs. We have generated a recombinant version of BoNT/B that consists of the light chain of the toxin fused to the protein transduction domain of the human immunodeficiency virus-1 (TAT peptide) and a hexahistidine tag. His 6 -TAT-BoNT/B-LC, expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography, penetrated membranes and exhibited strong enzymatic activity, as evidenced by cleavage of the SNARE synaptobrevin from rat brain synaptosomes and human sperm cells. Proteolytic attack of synaptobrevin hindered exocytosis triggered by a calcium ionophore in the latter. The novel tool reported herein disrupts the function of a SNARE protein within minutes in cells that may or may not express the receptors for the BoNT/B heavy chain, and without the need for transient transfection or permeabilization.
Translated Descriptions
Translated Description (Arabic)
تعد السموم العصبية للبوتولينوم (BoNTs) أدوات قيمة للكشف عن الآليات الجزيئية لإخراج الخلايا في الخلايا العصبية وغير العصبية بسبب نشاطها الببتيدية على الأشكال المتماثلة للخلايا الخارجية لبروتينات السنار. يتم إنتاجها بواسطة المطثية كعديد ببتيد أحادي السلسلة ينقسم بروتينيًا إلى مجالات خفيفة وحفازة مرتبطة تساهميًا عبر روابط ثاني كبريتيد إلى مجالات ثقيلة مستهدفة. هذا التنسيق لوحدتين فرعيتين مرتبطتين بروابط ثاني كبريتيد مطلوب للسمية العصبية الكاملة لـ BoNTs. لقد أنشأنا نسخة مؤتلفة من BoNT/B تتكون من السلسلة الخفيفة من السم المنصهر في مجال نقل البروتين لفيروس نقص المناعة البشرية -1 (ببتيد TAT) وعلامة هيكساهيستيدين. اخترق غشائه 6 - TAT - BoNT/B - LC، المعبر عنه بالإشريكية القولونية والمنقى بواسطة كروماتوغرافيا التقارب، الأغشية وأظهر نشاطًا إنزيميًا قويًا، كما يتضح من انشقاق السنار المتشابك من الجسيمات المتشابكة في دماغ الفئران وخلايا الحيوانات المنوية البشرية. أدى الهجوم التحليلي للبروتين من synaptobrevin إلى إعاقة طرد الخلايا الناجم عن حامل أيونات الكالسيوم في الأخير. تعطل الأداة الجديدة المذكورة هنا وظيفة بروتين SNARE في غضون دقائق في الخلايا التي قد تعبر أو لا تعبر عن مستقبلات السلسلة الثقيلة BoNT/B، ودون الحاجة إلى انتقال العدوى العابر أو النفاذية.Translated Description (French)
Les neurotoxines botuliniques (BoNT) sont des outils précieux pour dévoiler les mécanismes moléculaires de l'exocytose dans les cellules neuronales et non neuronales en raison de leur activité peptidase sur les isoformes exocytaires des protéines SNARE. Ils sont produits par Clostridia en tant que polypeptides à chaîne unique qui sont clivés de manière protéolytique en domaines catalytiques légers liés de manière covalente via des liaisons disulfure à des domaines lourds de ciblage. Ce format de deux sous-unités liées par des liaisons disulfure est nécessaire pour la neurotoxicité complète des BoNT. Nous avons généré une version recombinante de BoNT/B qui se compose de la chaîne légère de la toxine fusionnée au domaine de transduction protéique du virus de l'immunodéficience humaine-1 (peptide tat) et d'une étiquette hexahistidine. Sa 6 -TAT-BoNT/B-LC, exprimée chez Escherichia coli et purifiée par chromatographie d'affinité, pénétrait les membranes et présentait une forte activité enzymatique, comme en témoigne le clivage de la synaptobrevine SNARE des synaptosomes du cerveau de rat et des spermatozoïdes humains. L'attaque protéolytique de la synaptobrevine entrave l'exocytose déclenchée par un ionophore calcique chez ce dernier. Le nouvel outil décrit ici perturbe la fonction d'une protéine SNARE en quelques minutes dans des cellules qui peuvent ou non exprimer les récepteurs de la chaîne lourde BoNT/B, et sans nécessiter de transfection ou de perméabilisation transitoire.Translated Description (Spanish)
Las neurotoxinas botulínicas (BoNT) son herramientas valiosas para desvelar mecanismos moleculares de exocitosis en células neuronales y no neuronales debido a su actividad peptidasa sobre isoformas exocíticas de proteínas SNARE. Son producidos por Clostridia como polipéptidos monocatenarios que se escinden proteolíticamente en dominios catalíticos ligeros unidos covalentemente a través de enlaces disulfuro a dominios de direccionamiento pesados. Este formato de dos subunidades unidas por enlaces disulfuro es necesario para la neurotoxicidad completa de las BoNT. Hemos generado una versión recombinante de BoNT/B que consiste en la cadena ligera de la toxina fusionada al dominio de transducción de proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (péptido TAT) y una etiqueta de hexahistidina. His 6 -TAT-BoNT/B-LC, expresado en Escherichia coli y purificado por cromatografía de afinidad, penetró en las membranas y exhibió una fuerte actividad enzimática, como lo demuestra la escisión de la sinaptobrevina SNARE de sinaptosomas de cerebro de rata y espermatozoides humanos. El ataque proteolítico de la sinaptobrevina dificultó la exocitosis desencadenada por un ionóforo de calcio en esta última. La nueva herramienta informada en el presente documento interrumpe la función de una proteína SNARE en cuestión de minutos en células que pueden o no expresar los receptores para la cadena pesada de NTBo/B, y sin la necesidad de transfección o permeabilización transitoria.Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- التعبير عن وتنقية وتطبيق نسخة مؤتلفة تتخلل الغشاء من السلسلة الخفيفة من توكسين البوتولينوم ب
- Translated title (French)
- EXPRESSION, PURIFICATION ET APPLICATION D'UNE VERSION RECOMBINANTE ET PERMÉABLE À LA MEMBRANE DE LA CHAÎNE LÉGÈRE DE LA TOXINE BOTULINIQUE B
- Translated title (Spanish)
- EXPRESIÓN, PURIFICACIÓN Y APLICACIÓN DE UNA VERSIÓN RECOMBINANTE QUE PERMEA LA MEMBRANA DE LA CADENA LIGERA DE LA TOXINA BOTULÍNICA B
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W4400692746
- DOI
- 10.1042/bsr20240117