Published May 5, 2020
| Version v1
Publication
Open
Novel Strategies to Optimize the Amplification of Single-Stranded DNA
Creators
- 1. King Abdullah International Medical Research Center
- 2. University of Gabès
- 3. King Saud bin Abdulaziz University for Health Sciences
- 4. Institut National de la Recherche Scientifique
Description
The generation of single stranded DNA plays a key role in in vitro selection of DNA aptamers and in other molecular techniques such as DNA sequencing and microarrays. Here we describe three novel methodologies for ssDNA production and amplification. Furthermore, we describe some previously unnoticed aspects of random DNA amplification. Our results showed that in asymmetric PCR the addition of a high melting temperature reverse primer blocked at its 3′ end by a dideoxy nucleotide drives the reaction further towards ssDNA production. We demonstrated also that incorporation of internally inverted nucleotide/(s) in one primer can be used as a new method of polymerization termination. Using such modified primer, the PCR product includes two complementary DNA strands having different lengths and separable from one another by denaturing gel electrophoresis. In addition, we showed that nicking enzymes can be used to cleave the undesirable strand allowing the isolation of the target ssDNA strand.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
يلعب توليد الحمض النووي أحادي الجديلة دورًا رئيسيًا في الاختيار المختبري لأبتيمات الحمض النووي وفي التقنيات الجزيئية الأخرى مثل تسلسل الحمض النووي والمصفوفات الدقيقة. هنا نصف ثلاث منهجيات جديدة لإنتاج وتضخيم الحمض النووي الصبغي. علاوة على ذلك، نصف بعض الجوانب غير الملحوظة سابقًا لتضخيم الحمض النووي العشوائي. أظهرت نتائجنا أنه في تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل، تؤدي إضافة مادة تمهيدية عكسية ذات درجة حرارة انصهار عالية محجوبة في نهايتها 3 بواسطة نيوكليوتيد ثنائي الأكسيد إلى دفع التفاعل أكثر نحو إنتاج الحمض النووي الصبغي. لقد أثبتنا أيضًا أنه يمكن استخدام دمج النيوكليوتيدات /( النيوكليوتيدات) المقلوبة داخليًا في أحد المواد التمهيدية كطريقة جديدة لإنهاء البلمرة. باستخدام هذا التمهيدي المعدل، يتضمن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل خيطين مكملين للحمض النووي لهما أطوال مختلفة ويمكن فصلهما عن بعضهما البعض عن طريق تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي الهلامي. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أنه يمكن استخدام إنزيمات الخدش لشق الخيط غير المرغوب فيه مما يسمح بعزل خيط ssDNA المستهدف.Translated Description (French)
La génération d'ADN simple brin joue un rôle clé dans la sélection in vitro d'aptamères d'ADN et dans d'autres techniques moléculaires telles que le séquençage de l'ADN et les microréseaux. Nous décrivons ici trois nouvelles méthodologies pour la production et l'amplification de l'ADNss. En outre, nous décrivons certains aspects auparavant inaperçus de l'amplification aléatoire de l'ADN. Nos résultats ont montré que dans la PCR asymétrique, l'ajout d'une amorce inverse à haute température de fusion bloquée à son extrémité 3′ par un nucléotide didésoxy entraîne la réaction davantage vers la production d'ADNss. Nous avons également démontré que l'incorporation de nucléotide (s) inversé (s) interne (s) dans une amorce peut être utilisée comme nouvelle méthode de terminaison de polymérisation. En utilisant une telle amorce modifiée, le produit de PCR comprend deux brins d'ADN complémentaires ayant des longueurs différentes et séparables l'un de l'autre par électrophorèse sur gel dénaturant. De plus, nous avons montré que les enzymes de coupure peuvent être utilisées pour cliver le brin indésirable permettant l'isolement du brin d'ADNss cible.Translated Description (Spanish)
La generación de ADN monocatenario desempeña un papel clave en la selección in vitro de aptámeros de ADN y en otras técnicas moleculares como la secuenciación de ADN y las micromatrices. Aquí describimos tres metodologías novedosas para la producción y amplificación de ADNmc. Además, describimos algunos aspectos previamente desapercibidos de la amplificación aleatoria de ADN. Nuestros resultados mostraron que en la PCR asimétrica la adición de un cebador inverso de alta temperatura de fusión bloqueado en su extremo 3'por un nucleótido didesoxi impulsa aún más la reacción hacia la producción de ADNmc. También demostramos que la incorporación de nucleótidos invertidos internamente en un cebador se puede utilizar como un nuevo método de terminación de la polimerización. Usando dicho cebador modificado, el producto de PCR incluye dos cadenas de ADN complementarias que tienen diferentes longitudes y que se pueden separar entre sí mediante electroforesis en gel desnaturalizante. Además, demostramos que las enzimas de mellado se pueden utilizar para escindir la cadena indeseable, lo que permite el aislamiento de la cadena de ADNmc diana.Files
pdf.pdf
Files
(7.6 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:f0ba7d3240cdc74eff3f063d4749c8a5
|
7.6 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- استراتيجيات جديدة لتحسين تضخيم الحمض النووي أحادي السلسلة
- Translated title (French)
- Nouvelles stratégies pour optimiser l'amplification de l'ADN simple brin
- Translated title (Spanish)
- Estrategias novedosas para optimizar la amplificación del ADN monocatenario
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W3021124894
- DOI
- 10.3389/fbioe.2020.00401
References
- https://openalex.org/W1964858690
- https://openalex.org/W1967050880
- https://openalex.org/W1974315593
- https://openalex.org/W1989621679
- https://openalex.org/W2004864881
- https://openalex.org/W2043137047
- https://openalex.org/W2051139947
- https://openalex.org/W2058286973
- https://openalex.org/W2069620809
- https://openalex.org/W2074988418
- https://openalex.org/W2079321730
- https://openalex.org/W2095242988
- https://openalex.org/W2101525386
- https://openalex.org/W2104525153
- https://openalex.org/W2105398927
- https://openalex.org/W2111472235
- https://openalex.org/W2146799043
- https://openalex.org/W2401466727
- https://openalex.org/W2518862931
- https://openalex.org/W2897519319
- https://openalex.org/W4211092517
- https://openalex.org/W4293255582