Published August 31, 2021
| Version v1
Publication
Open
Targeted RNA-Seq Reveals the M. tuberculosis Transcriptome from an In Vivo Infection Model
Creators
- 1. Universidad Nacional Autónoma de México
- 2. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán
Description
The study of host-pathogen interactions using in vivo models with intracellular pathogens like Mycobacterium tuberculosis (Mtb) entails technical limitations, such as: (i) Selecting an efficient differential lysis system to enrich the pathogen cells; (ii) obtaining sufficient high-quality RNA; and (iii) achieving an efficient rRNA depletion. Thus, some authors had used flow cytometers to separate infected cells or significantly increase the sequencing depth of host–pathogen RNA libraries to observe the pathogens' gene expression. However, these options carry additional expenses in specialized equipment typically not available for all laboratories. Here, we propose an experimental protocol involving differential cell lysis and a probe-based ribosomal depletion to determine the gene expression of Mtb and its host during in vivo infection. This method increased the number of observed pathogen-expressed genes from 13 using the traditional RNA-seq approach to 702. After eliminating rRNA reads, we observed that 61.59% of Mtb sequences represented 702 genes, while 38.41% represented intergenic regions. Some of the most expressed genes codified for IS1081 (Rv2512c) transposase and eight PE-PGRS members, such as PGRS49 and PGRS50. As expected, a critical percent of the expressed genes codified for secreted proteins essential for infection, such as PE68, lppN, and LpqH. Moreover, three Mtb ncRNAs were highly expressed (small RNA MTS2823, transfer-messenger RNA RF00023, and ribozyme RF00010). Many of the host-expressed genes were related to the inflammation process and the expression of surfactant proteins such as the Sftpa and Sftpc, known to bind Mtb to alveolar macrophages and mi638, a microRNA with no previous associations with pulmonary diseases. The main objective of this study is to present the method, and a general catalog of the Mtb expressed genes at one point of the in vivo infection. We believe our method represents a different approach to the existing ones to study host–pathogen interactions in tuberculosis and other similar intracellular infections, without the necessity of specialized equipment.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
تنطوي دراسة تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة باستخدام نماذج في الجسم الحي مع مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل المتفطرة السلية (Mtb) على قيود فنية، مثل: (1) اختيار نظام تحلل تفاضلي فعال لإثراء الخلايا الممرضة ؛ (2) الحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي عالي الجودة ؛ و (3) تحقيق استنفاد فعال للحمض النووي الريبي. وهكذا، استخدم بعض المؤلفين مقاييس التدفق الخلوي لفصل الخلايا المصابة أو زيادة عمق تسلسل مكتبات الحمض النووي الريبي لمسببات الأمراض بشكل كبير لمراقبة التعبير الجيني لمسببات الأمراض. ومع ذلك، فإن هذه الخيارات تحمل نفقات إضافية في المعدات المتخصصة التي لا تتوفر عادة لجميع المختبرات. هنا، نقترح بروتوكولًا تجريبيًا يتضمن تحلل الخلايا التفاضلية واستنفاد الريبوسومات القائم على المسبار لتحديد التعبير الجيني لـ MtB ومضيفه أثناء العدوى في الجسم الحي. أدت هذه الطريقة إلى زيادة عدد الجينات المعبر عنها بمسببات الأمراض من 13 باستخدام نهج RNA - seq التقليدي إلى 702. بعد القضاء على قراءات الحمض النووي الريبوزي، لاحظنا أن 61.59 ٪ من تسلسلات Mtb تمثل 702 جينًا، في حين أن 38.41 ٪ تمثل مناطق بين الجينات. بعض الجينات الأكثر تعبيرًا المقننة لإنزيم ترانسبوزاز IS1081 (Rv2512c) وثمانية أعضاء PE - PGRS، مثل PGRS49 و PGRS50. كما هو متوقع، فإن نسبة مئوية حرجة من الجينات المعبر عنها مقننة للبروتينات المفرزة الضرورية للعدوى، مثل PE68 و lppN و LpqH. علاوة على ذلك، تم التعبير عن ثلاثة Mtb ncRNAs بشكل كبير (الحمض النووي الريبي الصغير MTS2823، والرسول الناقل RNA RF00023، والريبوزيم RF00010). ارتبطت العديد من الجينات المعبر عنها بالمضيف بعملية الالتهاب والتعبير عن البروتينات الخافضة للتوتر السطحي مثل Sftpa و Sftpc، والمعروفة بربط Mtb بالبلاعم السنخية و mi638، وهو microRNA مع عدم وجود ارتباطات سابقة بالأمراض الرئوية. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تقديم الطريقة، وفهرس عام لجينات Mtb المعبر عنها في نقطة واحدة من العدوى في الجسم الحي. نعتقد أن طريقتنا تمثل نهجًا مختلفًا عن تلك الموجودة لدراسة تفاعلات مسببات الأمراض في السل وغيرها من الالتهابات المماثلة داخل الخلايا، دون الحاجة إلى معدات متخصصة.Translated Description (French)
L'étude des interactions hôte-pathogène à l'aide de modèles in vivo avec des pathogènes intracellulaires comme Mycobacterium tuberculosis (Mtb) entraîne des limitations techniques, telles que : (i) la sélection d'un système de lyse différentielle efficace pour enrichir les cellules pathogènes ; (ii) l'obtention d'ARN de haute qualité en quantité suffisante ; et (iii) la réalisation d'une déplétion efficace en ARNr. Ainsi, certains auteurs avaient utilisé des cytomètres de flux pour séparer les cellules infectées ou augmenter de manière significative la profondeur de séquençage des bibliothèques d'ARN hôte-pathogène pour observer l'expression génique des agents pathogènes. Cependant, ces options entraînent des dépenses supplémentaires dans des équipements spécialisés qui ne sont généralement pas disponibles pour tous les laboratoires. Nous proposons ici un protocole expérimental impliquant une lyse cellulaire différentielle et une déplétion ribosomique à base de sonde pour déterminer l'expression génique du Mtb et de son hôte lors d'une infection in vivo. Cette méthode a augmenté le nombre de gènes observés exprimés par les agents pathogènes de 13 en utilisant l'approche traditionnelle RNA-seq à 702. Après élimination des lectures d'ARNr, nous avons observé que 61,59 % des séquences Mtb représentaient 702 gènes, tandis que 38,41 % représentaient des régions intergéniques. Certains des gènes les plus exprimés codifiés pour la transposase IS1081 (Rv2512c) et huit membres PE-PGRS, tels que PGRS49 et PGRS50. Comme prévu, un pourcentage critique des gènes exprimés codifiés pour les protéines sécrétées essentielles pour l'infection, telles que PE68, lppN et LpqH. De plus, trois ARNnc Mtb étaient fortement exprimés (petit ARN MTS2823, ARN messager de transfert RF00023 et ribozyme RF00010). De nombreux gènes exprimés par l'hôte étaient liés au processus d'inflammation et à l'expression de protéines tensioactives telles que le Sftpa et le Sftpc, connus pour se lier au Mtb aux macrophages alvéolaires et au mi638, un microARN sans association préalable avec les maladies pulmonaires. L'objectif principal de cette étude est de présenter la méthode, et un catalogue général des gènes exprimés en Mtb à un moment de l'infection in vivo. Nous croyons que notre méthode représente une approche différente de celles existantes pour étudier les interactions hôte-pathogène dans la tuberculose et d'autres infections intracellulaires similaires, sans la nécessité d'un équipement spécialisé.Translated Description (Spanish)
El estudio de las interacciones huésped-patógeno utilizando modelos in vivo con patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis (Mtb) conlleva limitaciones técnicas, tales como: (i) Seleccionar un sistema de lisis diferencial eficiente para enriquecer las células patógenas; (ii) obtener suficiente ARN de alta calidad; y (iii) lograr un agotamiento eficiente del ARNr. Por lo tanto, algunos autores habían utilizado citómetros de flujo para separar las células infectadas o aumentar significativamente la profundidad de secuenciación de las bibliotecas de ARN huésped-patógeno para observar la expresión génica de los patógenos. Sin embargo, estas opciones conllevan gastos adicionales en equipos especializados que generalmente no están disponibles para todos los laboratorios. Aquí, proponemos un protocolo experimental que implica la lisis celular diferencial y un agotamiento ribosómico basado en sondas para determinar la expresión génica de Mtb y su huésped durante la infección in vivo. Este método aumentó el número de genes observados expresados en patógenos de 13 utilizando el enfoque tradicional de RNA-seq a 702. Después de eliminar las lecturas de ARNr, observamos que el 61,59% de las secuencias de Mtb representaban 702 genes, mientras que el 38,41% representaban regiones intergénicas. Algunos de los genes más expresados codificaron para la transposasa IS1081 (Rv2512c) y ocho miembros de PE-PGRS, como PGRS49 y PGRS50. Como era de esperar, un porcentaje crítico de los genes expresados codificaba proteínas secretadas esenciales para la infección, como PE68, lppN y LpqH. Además, tres ARNnc de Mtb se expresaron altamente (ARN pequeño MTS2823, ARN mensajero de transferencia RF00023 y ribozima RF00010). Muchos de los genes expresados en el huésped estaban relacionados con el proceso de inflamación y la expresión de proteínas tensioactivas como Sftpa y Sftpc, que se sabe que unen Mtb a macrófagos alveolares y mi638, un microARN sin asociaciones previas con enfermedades pulmonares. El objetivo principal de este estudio es presentar el método y un catálogo general de los genes expresados en Mtb en un punto de la infección in vivo. Creemos que nuestro método representa un enfoque diferente a los existentes para estudiar las interacciones huésped-patógeno en la tuberculosis y otras infecciones intracelulares similares, sin la necesidad de equipo especializado.Files
pdf.pdf
Files
(2.4 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:b4a3768184d7ed921180e1ba1449418f
|
2.4 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- يكشف تسلسل الحمض النووي الريبوزي المستهدف عن M. Tuberculosis Transcriptome من نموذج العدوى في الجسم الحي
- Translated title (French)
- La séquence d'ARN ciblée révèle le transcriptome de M. tuberculosis à partir d'un modèle d'infection in vivo
- Translated title (Spanish)
- La sec. de ARN dirigida revela el transcriptoma de M. tuberculosis a partir de un modelo de infección in vivo
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W3197600755
- DOI
- 10.3390/biology10090848
References
- https://openalex.org/W1544053969
- https://openalex.org/W1965389646
- https://openalex.org/W1965497254
- https://openalex.org/W1972750878
- https://openalex.org/W1979076223
- https://openalex.org/W1985750311
- https://openalex.org/W1987733838
- https://openalex.org/W1996371386
- https://openalex.org/W2001338440
- https://openalex.org/W2007097682
- https://openalex.org/W2007752039
- https://openalex.org/W2023370324
- https://openalex.org/W2037432461
- https://openalex.org/W2043867255
- https://openalex.org/W2049425687
- https://openalex.org/W2052297861
- https://openalex.org/W2086237232
- https://openalex.org/W2090197974
- https://openalex.org/W2091376961
- https://openalex.org/W2095299197
- https://openalex.org/W2101417884
- https://openalex.org/W2113577480
- https://openalex.org/W2118938986
- https://openalex.org/W2123266729
- https://openalex.org/W2126245681
- https://openalex.org/W2133253129
- https://openalex.org/W2133418861
- https://openalex.org/W2141152740
- https://openalex.org/W2144760388
- https://openalex.org/W2150390148
- https://openalex.org/W2155935320
- https://openalex.org/W2163437751
- https://openalex.org/W2165201729
- https://openalex.org/W2165539745
- https://openalex.org/W2174612238
- https://openalex.org/W2177512550
- https://openalex.org/W2397891977
- https://openalex.org/W2501326905
- https://openalex.org/W2531627965
- https://openalex.org/W2586329336
- https://openalex.org/W2798137171
- https://openalex.org/W2996703088
- https://openalex.org/W2999462941
- https://openalex.org/W56036994