Two dimensional gel electrophoresis (2-DE) for high-throughput proteome analyses of Mycoplasma bovis
Creators
- 1. The University of Agriculture, Peshawar
- 2. Huazhong Agricultural University
- 3. Khyber Medical University
Description
Expression proteomics approaches do not only directly confirm protein coding genes of sequenced genomes but also facilitate resolution of minute qualitative protein differences and improve the quality of genome annotation. Despite development of many tools, use of 2-DE coupled with MS in proteomics is not uncommon. With an accelerated trend of genome sequencing of microorganisms, proteome analysis of animal pathogens with 2-DE has gained more attention in the last decade. Therefore, in this study primarily the protein extraction, sample preparation and loading, IPG strip rehydration, IEF, and SDS-PAGE conditions were improved for high throughput resolution and reproducible 2-DE map of proteins of Mycoplasma bovis HB0801 (M. bovis HB0801- Chinese Strain), a pneumonia pathogen in feedlot cattle, and its attenuated strains. Literally, higher amount of proteins was extracted exploiting the French pressure cell coupled with TCA precipitation when compared to the sonication method. Total protein concentration was determined using a 2D quant Kit. About 330–380 μg TCA treated protein sample, solubilized in calibrated rehydration solution, loaded on 17 cm IPG gel strip (pH 3–10 NL) followed by active rehydration at 50V and isoelectric focusing at final 10 000 Volt (33 uA/gel strip) for 80kVh had revealed well resolved proteins spots on 10% gel stained by CBB R250 (0.15%), representing 83–89% of the total protein coding genes of M. bovis HB0801, estimated by PD Quest (Bio-Rad, USA). Conclusively, this effort attempted to provide more precise 2-DE platform and suitable conditions, after extensive calibration, for future comprehensive proteome and immunoproteome analyses and future research on the elucidation of factors related to pathogenesis of M. bovis in cattle.
Translated Descriptions
Translated Description (Arabic)
لا تؤكد مناهج علم البروتينات التعبيرية بشكل مباشر جينات ترميز البروتين للجينومات المتسلسلة فحسب، بل تسهل أيضًا حل اختلافات البروتين النوعي الدقيقة وتحسين جودة التعليق التوضيحي للجينوم. على الرغم من تطوير العديد من الأدوات، فإن استخدام 2 - DE إلى جانب MS في علم البروتينات ليس من غير المألوف. مع الاتجاه المتسارع لتسلسل الجينوم للكائنات الحية الدقيقة، اكتسب تحليل البروتينات لمسببات الأمراض الحيوانية مع 2 - DE المزيد من الاهتمام في العقد الماضي. لذلك، في هذه الدراسة في المقام الأول، تم تحسين ظروف استخراج البروتين، وإعداد العينات وتحميلها، وإماهة شريط مولد النبض القابل للزرع، و IEF، و SDS - PAGE من أجل دقة إنتاجية عالية وخريطة 2 - DE قابلة للتكرار لبروتينات Mycoplasma bovis HB0801 (M. bovis HB0801 - السلالة الصينية)، وممرض الالتهاب الرئوي في الماشية المغذية، وسلالاتها الموهنة. حرفيًا، تم استخراج كمية أعلى من البروتينات باستخدام خلية الضغط الفرنسية المقترنة بترسيب TCA عند مقارنتها بطريقة الصوتنة. تم تحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام مجموعة كمية ثنائية الأبعاد. حوالي 330–380 ميكروغرام من عينة البروتين المعالج TCA، المذاب في محلول الإماهة المعايرة، المحملة على شريط هلام IPG 17 سم (الرقم الهيدروجيني 3–10 NL) متبوعًا بالإماهة النشطة عند 50 فولت والتركيز الكهربائي المتساوي عند 10000 فولت (33 uA/شريط هلام) النهائي لـ 80 كيلو فولت ساعة قد كشف عن بقع بروتينات متحللة جيدًا على 10 ٪ من الجل الملون بواسطة CBB R250 (0.15 ٪)، وهو ما يمثل 83-89 ٪ من إجمالي جينات ترميز البروتين لـ M. bovis HB0801، المقدرة بواسطة PD Quest (Bio - Rad، الولايات المتحدة الأمريكية). بشكل قاطع، حاول هذا الجهد توفير منصة 2 - DE أكثر دقة وظروف مناسبة، بعد معايرة واسعة النطاق، لتحليلات البروتين والبروتين المناعي الشاملة في المستقبل والبحوث المستقبلية حول توضيح العوامل المتعلقة بإمراض M. bovis في الماشية.Translated Description (French)
Les approches de protéomique d'expression confirment non seulement directement les gènes codant pour les protéines des génomes séquencés, mais facilitent également la résolution de minuscules différences qualitatives de protéines et améliorent la qualité de l'annotation du génome. Malgré le développement de nombreux outils, l'utilisation du 2-DE couplé à la SEP en protéomique n'est pas rare. Avec une tendance accélérée du séquençage du génome des micro-organismes, l'analyse du protéome des agents pathogènes animaux avec 2-DE a attiré plus d'attention au cours de la dernière décennie. Par conséquent, dans cette étude, principalement l'extraction des protéines, la préparation et le chargement des échantillons, la réhydratation des bandes IPG, l'IEF et les conditions SDS-PAGE ont été améliorées pour une résolution à haut débit et une carte 2DE reproductible des protéines de Mycoplasma bovis HB0801 (M. bovis HB0801 - souche chinoise), un pathogène de la pneumonie chez les bovins de parc d'engraissement, et de ses souches atténuées. Littéralement, une quantité plus élevée de protéines a été extraite en exploitant la cellule de pression française couplée à la précipitation de TCA par rapport à la méthode de sonication. La concentration en protéines totales a été déterminée à l'aide d'un kit quant 2D. Environ 330–380 μg d'échantillon de protéines traitées au TCA, solubilisées dans une solution de réhydratation calibrée, chargées sur une bande de gel IPG de 17 cm (pH 3–10 NL) suivie d'une réhydratation active à 50 V et d'une focalisation isoélectrique à 10 000 volts (33 uA/bande de gel) finale pour 80 kVh avaient révélé des taches de protéines bien résolues sur 10% de gel coloré par CBB R250 (0,15%), représentant 83–89% du total des gènes codant pour les protéines de M. bovis HB0801, estimé par PD Quest (Bio-Rad, USA). En conclusion, cet effort a tenté de fournir une plate-forme 2-D plus précise et des conditions appropriées, après un étalonnage approfondi, pour de futures analyses complètes du protéome et de l'immunoprotéome et de futures recherches sur l'élucidation des facteurs liés à la pathogenèse de M. bovis chez les bovins.Translated Description (Spanish)
Los enfoques de proteómica de expresión no solo confirman directamente los genes codificantes de proteínas de genomas secuenciados, sino que también facilitan la resolución de diferencias cualitativas mínimas de proteínas y mejoran la calidad de la anotación del genoma. A pesar del desarrollo de muchas herramientas, el uso de 2-DE junto con MS en proteómica no es infrecuente. Con una tendencia acelerada de secuenciación del genoma de microorganismos, el análisis del proteoma de patógenos animales con 2-DE ha ganado más atención en la última década. Por lo tanto, en este estudio se mejoraron principalmente las condiciones de extracción de proteínas, preparación y carga de muestras, rehidratación de tiras de IPG, IEF y SDS-PAGE para una alta resolución de rendimiento y un mapa 2-DE reproducible de proteínas de Mycoplasma bovis HB0801 (M. bovis HB0801- Cepa china), un patógeno de neumonía en ganado de engorde y sus cepas atenuadas. Literalmente, se extrajo una mayor cantidad de proteínas explotando la celda de presión francesa junto con la precipitación de TCA en comparación con el método de sonicación. La concentración total de proteína se determinó utilizando un kit 2D Quant. Aproximadamente 330–380 μg de muestra de proteína tratada con TCA, solubilizada en solución de rehidratación calibrada, cargada en una tira de gel IPG de 17 cm (pH 3–10 NL) seguida de rehidratación activa a 50 V y enfoque isoeléctrico a 10 000 voltios finales (33 uA/tira de gel) para 80 kVh había revelado manchas de proteínas bien resueltas en gel al 10% teñido por CBB R250 (0,15%), lo que representa el 83-89% del total de genes codificantes de proteínas de M. bovis HB0801, estimado por PD Quest (Bio-Rad, EE. UU.). En conclusión, este esfuerzo intentó proporcionar una plataforma 2-DE más precisa y condiciones adecuadas, después de una calibración exhaustiva, para futuros análisis exhaustivos de proteomas e inmunoproteomas y futuras investigaciones sobre la elucidación de factores relacionados con la patogénesis de M. bovis en ganado.Files
1906.pdf
Files
(3.8 kB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:5b48a2ac0793e201b50338b7b9e40176
|
3.8 kB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- الرحلان الكهربائي الهلامي ثنائي الأبعاد (2 - DE) لتحليل البروتين عالي الإنتاجية للميكوبلازما البقرية
- Translated title (French)
- Électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-DE) pour les analyses de protéome à haut débit de Mycoplasma bovis
- Translated title (Spanish)
- Electroforesis bidimensional en gel (2-DE) para análisis de proteoma de alto rendimiento de Mycoplasma bovis
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2963796290
- DOI
- 10.18388/abp.2019_2794