Published January 1, 2021
| Version v1
Publication
Open
Optimization of the isolation procedure and culturing conditions for hepatic stellate cells obtained from mouse
Creators
- 1. Ho Chi Minh City University of Science
- 2. Vietnam National University Ho Chi Minh City
- 3. Ho Chi Minh City International University
- 4. University of Illinois at Chicago
- 5. Illinois College
- 6. Vietnam Academy of Science and Technology
Description
Abstract Liver fibrosis (LF) mortality rate is approximately 2 million per year. Irrespective of the etiology of LF, a key element in its development is the transition of hepatic stellate cells (HSCs) from a quiescent phenotype to a myofibroblast-like cell with the production of fibrotic proteins. It is necessary to define optimal isolation and culturing conditions for good HSCs yield and proper phenotype preservation for studying the activation of HSCs in vitro. In the present study, the optimal conditions of HSC isolation and culture were examined to maintain the HSC's undifferentiated phenotype. HSCs were isolated from Balb/c mice liver using Nycodenz, 8, 9.6, and 11%. The efficiency of the isolation procedure was evaluated by cell counting and purity determination by flow cytometry. Quiescent HSCs were cultured in test media supplemented with different combinations of fetal bovine serum (FBS), glutamine (GLN), vitamin A (vitA), insulin, and glucose. The cells were assessed at days 3 and 7 of culture by evaluating the morphology, proliferation using cell counting kit-8, lipid storage using Oil Red O (ORO) staining, expression of a-smooth muscle actin, collagen I, and lecithin-retinol acyltransferase by qRT-PCR and immunocytochemistry (ICC). The results showed that Nycodenz, at 9.6%, yielded the best purity and quantity of HSCs. Maintenance of HSC undifferentiated phenotype was achieved optimizing culturing conditions (serum-free Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with glucose (100 mg/dl), GLN (0.5 mM), vitA (100 μM), and insulin (50 ng/ml)) with a certain degree of proliferation allowing their perpetuation in culture. In conclusion, we have defined optimal conditions for HSCs isolation and culture.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
يبلغ معدل وفيات تليف الكبد التجريدي (LF) حوالي 2 مليون سنويًا. بغض النظر عن مسببات LF، فإن العنصر الرئيسي في تطوره هو انتقال الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) من نمط ظاهري هادئ إلى خلية تشبه الأرومة الليفية العضلية مع إنتاج البروتينات الليفية. من الضروري تحديد ظروف العزل والاستزراع المثلى لمحصول HSCs الجيد والحفاظ على النمط الظاهري المناسب لدراسة تنشيط HSCs في المختبر. في هذه الدراسة، تم فحص الظروف المثلى لعزل HSC وزراعته للحفاظ على النمط الظاهري غير المتمايز لـ HSC. تم عزل HSCs من كبد فئران Balb/c باستخدام Nycodenz و 8 و 9.6 و 11 ٪. تم تقييم كفاءة إجراء العزل عن طريق عد الخلايا وتحديد النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي. تمت زراعة الخلايا الجذعية البشرية الهادئة في وسائط اختبار مكملة بمجموعات مختلفة من مصل الأبقار الجنيني (FBS) والجلوتامين (GLN) وفيتامين أ (VitA) والأنسولين والجلوكوز. تم تقييم الخلايا في اليومين الثالث والسابع من الاستزراع من خلال تقييم التشكل، والتكاثر باستخدام مجموعة عد الخلايا-8، وتخزين الدهون باستخدام صبغة O (ORO) الزيتية الحمراء، والتعبير عن الأكتين العضلي الملساء، والكولاجين I، وناقلة أسيل الليسيثين ريتينول بواسطة qRT - PCR والكيمياء المناعية (ICC). أظهرت النتائج أن Nycodenz، عند 9.6 ٪، أنتج أفضل نقاء وكمية من HSCs. تم تحقيق الحفاظ على النمط الظاهري غير المتمايز لـ HSC مما أدى إلى تحسين ظروف الاستزراع (متوسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو الخالي من المصل والمكمل بالجلوكوز (100 مجم/ديسيلتر)، والغلوكوز (0.5 ملليمتر)، والفيتامين أ (100 ميكرومتر)، والأنسولين (50 نانوغرام/مل)) مع درجة معينة من الانتشار مما يسمح بإدامتها في الاستزراع. في الختام، حددنا الظروف المثلى لعزل وثقافة HSCs.Translated Description (French)
Résumé Le taux de mortalité par fibrose hépatique (FL) est d'environ 2 millions par an. Indépendamment de l'étiologie de la LF, un élément clé de son développement est la transition des cellules stellaires hépatiques (CSH) d'un phénotype quiescent à une cellule de type myofibroblaste avec la production de protéines fibrotiques. Il est nécessaire de définir des conditions optimales d'isolement et de culture pour un bon rendement des CSH et une bonne préservation du phénotype pour étudier l'activation des CSH in vitro. Dans la présente étude, les conditions optimales d'isolement et de culture des CSH ont été examinées pour maintenir le phénotype indifférencié des CSH. Les CSH ont été isolées du foie de souris Balb/c à l'aide de Nycodenz, 8, 9,6 et 11 %. L'efficacité de la procédure d'isolement a été évaluée par comptage cellulaire et détermination de la pureté par cytométrie de flux. Les CSH quiescentes ont été cultivées dans des milieux de test supplémentés avec différentes combinaisons de sérum bovin fœtal (FBS), de glutamine (GLN), de vitamine A (vitA), d'insuline et de glucose. Les cellules ont été évaluées aux jours 3 et 7 de la culture en évaluant la morphologie, la prolifération à l'aide du kit de comptage cellulaire 8, le stockage des lipides à l'aide de la coloration Oil Red O (ORO), l'expression de l'actine musculaire a-lisse, du collagène I et de la lécithine-rétinol acyltransférase par qRT-PCR et immunocytochimie (ICC). Les résultats ont montré que le Nycodenz, à 9,6%, donnait la meilleure pureté et quantité de CSH. Le maintien du phénotype indifférencié HSC a été réalisé en optimisant les conditions de culture (Milieu d'Aigle Modifié de Dulbecco sans sérum (DMEM) supplémenté en glucose (100 mg/dl), GLN (0,5 mM), vitA (100 μM) et insuline (50 ng/ml)) avec un certain degré de prolifération permettant leur perpétuation en culture. En conclusion, nous avons défini des conditions optimales pour l'isolement et la culture des CSH.Translated Description (Spanish)
Resumen La tasa de mortalidad por fibrosis hepática (LF) es de aproximadamente 2 millones por año. Independientemente de la etiología de la LF, un elemento clave en su desarrollo es la transición de las células estrelladas hepáticas (HSC) de un fenotipo quiescente a una célula similar a los miofibroblastos con la producción de proteínas fibróticas. Es necesario definir las condiciones óptimas de aislamiento y cultivo para un buen rendimiento de las HSC y una adecuada preservación del fenotipo para estudiar la activación de las HSC in vitro. En el presente estudio, se examinaron las condiciones óptimas de aislamiento y cultivo de HSC para mantener el fenotipo indiferenciado de las HSC. Las HSC se aislaron del hígado de ratones Balb/c usando Nycodenz, 8, 9.6 y 11%. La eficiencia del procedimiento de aislamiento se evaluó mediante recuento de células y determinación de pureza mediante citometría de flujo. Las HSC en reposo se cultivaron en medios de prueba complementados con diferentes combinaciones de suero fetal bovino (FBS), glutamina (GLN), vitamina A (vitA), insulina y glucosa. Las células se evaluaron en los días 3 y 7 de cultivo mediante la evaluación de la morfología, la proliferación mediante el uso del kit de recuento celular-8, el almacenamiento de lípidos mediante el uso de tinción con Oil Red O (ORO), la expresión de a-actina de músculo liso, colágeno I y lecitina-retinol aciltransferasa mediante qRT-PCR e inmunocitoquímica (ICC). Los resultados mostraron que Nycodenz, con un 9,6%, produjo la mejor pureza y cantidad de HSC. El mantenimiento del fenotipo indiferenciado de HSC se logró optimizando las condiciones de cultivo (medio de Eagle modificado de Dulbecco sin suero (DMEM) suplementado con glucosa (100 mg/dl), GLN (0,5 mM), vitA (100 μM) e insulina (50 ng/ml)) con un cierto grado de proliferación que permite su perpetuación en cultivo. En conclusión, hemos definido las condiciones óptimas para el aislamiento y el cultivo de HSC.Files
bsr-2020-2514.pdf.pdf
Files
(16.0 kB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:bac5d848317c14d6d79f40cc7969e056
|
16.0 kB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تحسين إجراء العزل وظروف زراعة الخلايا النجمية الكبدية التي تم الحصول عليها من الفأر
- Translated title (French)
- Optimisation de la procédure d'isolement et des conditions de culture pour les cellules stellaires hépatiques obtenues à partir de souris
- Translated title (Spanish)
- Optimización del procedimiento de aislamiento y las condiciones de cultivo para células estrelladas hepáticas obtenidas de ratón
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W3118040750
- DOI
- 10.1042/bsr20202514
References
- https://openalex.org/W1212464357
- https://openalex.org/W122682860
- https://openalex.org/W1521714666
- https://openalex.org/W1964867024
- https://openalex.org/W1965588383
- https://openalex.org/W196694067
- https://openalex.org/W1972824116
- https://openalex.org/W1981712053
- https://openalex.org/W1995378781
- https://openalex.org/W2002733746
- https://openalex.org/W2004076913
- https://openalex.org/W2016498524
- https://openalex.org/W2018230845
- https://openalex.org/W2037725729
- https://openalex.org/W2040617968
- https://openalex.org/W2041911908
- https://openalex.org/W2046451707
- https://openalex.org/W2049016069
- https://openalex.org/W2050569765
- https://openalex.org/W2051906566
- https://openalex.org/W2081515102
- https://openalex.org/W2082645615
- https://openalex.org/W2091986760
- https://openalex.org/W2096408748
- https://openalex.org/W2107922244
- https://openalex.org/W2115782119
- https://openalex.org/W2122530058
- https://openalex.org/W2137793154
- https://openalex.org/W2139232831
- https://openalex.org/W2173474465
- https://openalex.org/W2254177481
- https://openalex.org/W2323637528
- https://openalex.org/W2400013099
- https://openalex.org/W2430327426
- https://openalex.org/W2624732253
- https://openalex.org/W2744918184
- https://openalex.org/W2748435473
- https://openalex.org/W2771345740
- https://openalex.org/W2884583250
- https://openalex.org/W2913128985
- https://openalex.org/W2950640427
- https://openalex.org/W2971789821
- https://openalex.org/W4245830993
- https://openalex.org/W4255184642