Published February 15, 2012
| Version v1
Publication
Open
A point mutation in the DNA-binding domain of HPV-2 E2 protein increases its DNA-binding capacity and reverses its transcriptional regulatory activity on the viral early promoter
Creators
- 1. National Institute for Viral Disease Control and Prevention
- 2. Institute of Biophysics
- 3. Xi'an Jiaotong University
- 4. Chinese Academy of Sciences
- 5. Institute of Microbiology
Description
The human papillomavirus (HPV) E2 protein is a multifunctional DNA-binding protein. The transcriptional activity of HPV E2 is mediated by binding to its specific binding sites in the upstream regulatory region of the HPV genomes. Previously we reported a HPV-2 variant from a verrucae vulgaris patient with huge extensive clustered cutaneous, which have five point mutations in its E2 ORF, L118S, S235P, Y287H, S293R and A338V. Under the control of HPV-2 LCR, co-expression of the mutated HPV E2 induced an increased activity on the viral early promoter. In the present study, a series of mammalian expression plasmids encoding E2 proteins with one to five amino acid (aa) substitutions for these mutations were constructed and transfected into HeLa, C33A and SiHa cells.CAT expression assays indicated that the enhanced promoter activity was due to the co-expressions of the E2 constructs containing A338V mutation within the DNA-binding domain. Western blots analysis demonstrated that the transiently transfected E2 expressing plasmids, regardless of prototype or the A338V mutant, were continuously expressed in the cells. To study the effect of E2 mutations on its DNA-binding activity, a serial of recombinant E2 proteins with various lengths were expressed and purified. Electrophoresis mobility shift assays (EMSA) showed that the binding affinity of E2 protein with A338V mutation to both an artificial probe with two E2 binding sites or HPV-2 and HPV-16 promoter-proximal LCR sequences were significantly stronger than that of the HPV-2 prototype E2. Furthermore, co-expression of the construct containing A338V mutant exhibited increased activities on heterologous HPV-16 early promoter P97 than that of prototype E2.These results suggest that the mutation from Ala to Val at aa 338 is critical for E2 DNA-binding and its transcriptional regulation.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
بروتين فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) E2 هو بروتين ملزم للحمض النووي متعدد الوظائف. يتم التوسط في نشاط النسخ لفيروس الورم الحليمي البشري E2 من خلال الربط بمواقع الربط المحددة في المنطقة التنظيمية الأولية لجينومات فيروس الورم الحليمي البشري. في السابق، أبلغنا عن متغير فيروس الورم الحليمي البشري 2 من مريض ثؤلول شائع مصاب بجلد عنقودي واسع النطاق، والذي لديه طفرات من خمس نقاط في E2 ORF و L118S و S235P و Y287H و S293R و A338V. تحت سيطرة فيروس الورم الحليمي البشري-2 LCR، أدى التعبير المشترك عن فيروس الورم الحليمي البشري E2 المتحور إلى زيادة النشاط على المروج الفيروسي المبكر. في هذه الدراسة، تم بناء سلسلة من بلازميدات تعبير الثدييات التي تشفر بروتينات E2 مع بديل واحد إلى خمسة أحماض أمينية (aa) لهذه الطفرات ونقلها إلى خلايا هيلا و C33A و SiHa. أشارت فحوصات تعبير CAT إلى أن نشاط المعزز المعزز كان بسبب التعبيرات المشتركة لبنيات E2 التي تحتوي على طفرة A338V داخل مجال ربط الحمض النووي. أظهر تحليل البقع الغربية أن البلازميدات المعبرة عن E2 المنقولة عابرًا، بغض النظر عن النموذج الأولي أو متحولة A338V، يتم التعبير عنها باستمرار في الخلايا. لدراسة تأثير طفرات E2 على نشاط ربط الحمض النووي، تم التعبير عن سلسلة من بروتينات E2 المؤتلفة بأطوال مختلفة وتنقيتها. أظهرت فحوصات التحول الحركي الكهربائي (EMSA) أن تقارب الارتباط لبروتين E2 مع طفرة A338V إلى كل من المسبار الاصطناعي مع موقعين ربط E2 أو تسلسلات LCR الدانية المعززة لفيروس الورم الحليمي البشري 2 و HPV -16 كانت أقوى بكثير من النموذج الأولي لفيروس الورم الحليمي البشري 2 E2. علاوة على ذلك، أظهر التعبير المشترك عن البنية التي تحتوي على طفرة A338V زيادة الأنشطة على المروج المبكر لفيروس الورم الحليمي البشري 16 غير المتجانس P97 مقارنة بالنموذج الأولي E2. تشير هذه النتائج إلى أن الطفرة من ALA إلى VAL في AA 338 أمر بالغ الأهمية لربط الحمض النووي E2 وتنظيمه النصي.Translated Description (French)
La protéine E2 du papillomavirus humain (VPH) est une protéine multifonctionnelle de liaison à l'ADN. L'activité transcriptionnelle du VPH E2 est médiée par la liaison à ses sites de liaison spécifiques dans la région régulatrice en amont des génomes du VPH. Auparavant, nous avions signalé une variante du VPH-2 chez un patient verrucae vulgaris présentant d'énormes amas cutanés étendus, qui présentaient des mutations en cinq points dans son ORF E2, L118S, S235P, Y287H, S293R et A338V. Sous le contrôle de HPV-2 LCR, la co-expression de l'HPV E2 muté a induit une activité accrue sur le promoteur précoce viral. Dans la présente étude, une série de plasmides d'expression de mammifères codant pour les protéines E2 avec une à cinq substitutions d'acides aminés (aa) pour ces mutations ont été construits et transfectés dans des cellules HeLa, C33A et SiHa. Les tests d'expression CAT ont indiqué que l'activité accrue du promoteur était due aux co-expressions des constructions E2 contenant la mutation A338V dans le domaine de liaison à l'ADN. L'analyse par Western blots a démontré que les plasmides exprimant E2 transfectés de manière transitoire, quel que soit le prototype ou le mutant A338V, étaient exprimés en continu dans les cellules. Pour étudier l'effet des mutations E2 sur son activité de liaison à l'ADN, une série de protéines E2 recombinantes de différentes longueurs a été exprimée et purifiée. Les tests de mobilité par électrophorèse (EMSA) ont montré que l'affinité de liaison de la protéine E2 avec la mutation A338V à la fois à une sonde artificielle avec deux sites de liaison E2 ou à des séquences LCR proximales promotrices HPV-2 et HPV-16 était significativement plus forte que celle du prototype E2 HPV-2. De plus, la co-expression de la construction contenant le mutant A338V a montré des activités accrues sur le promoteur précoce P97 hétérologue de HPV-16 que celle du prototype E2. Ces résultats suggèrent que la mutation de Ala à Val à aa 338 est critique pour la liaison à l'ADN de E2 et sa régulation transcriptionnelle.Translated Description (Spanish)
La proteína E2 del virus del papiloma humano (VPH) es una proteína multifuncional de unión al ADN. La actividad transcripcional de E2 del VPH está mediada por la unión a sus sitios de unión específicos en la región reguladora aguas arriba de los genomas del VPH. Anteriormente, informamos una variante de VPH-2 de un paciente con verrugas vulgares con gran extensión cutánea agrupada, que tiene cinco mutaciones puntuales en su ORF E2, L118S, S235P, Y287H, S293R y A338V. Bajo el control de la LCR de HPV-2, la coexpresión de la E2 de HPV mutada indujo una mayor actividad en el promotor temprano viral. En el presente estudio, se construyó una serie de plásmidos de expresión de mamíferos que codifican proteínas E2 con sustituciones de uno a cinco aminoácidos (aa) para estas mutaciones y se transfectaron en células HeLa, C33A y SiHa. Los ensayos de expresión CAT indicaron que la actividad promotora mejorada se debía a las coexpresiones de las construcciones E2 que contenían la mutación A338V dentro del dominio de unión al ADN. El análisis de transferencias Western demostró que los plásmidos que expresan E2 transfectados transitoriamente, independientemente del prototipo o del mutante A338V, se expresaban continuamente en las células. Para estudiar el efecto de las mutaciones de E2 sobre su actividad de unión al ADN, se expresó y purificó una serie de proteínas E2 recombinantes con varias longitudes. Los ensayos de desplazamiento de movilidad por electroforesis (EMSA) mostraron que la afinidad de unión de la proteína E2 con la mutación A338V a una sonda artificial con dos sitios de unión a E2 o secuencias LCR próximas al promotor de HPV-2 y HPV-16 fue significativamente más fuerte que la del prototipo E2 de HPV-2. Además, la coexpresión de la construcción que contiene el mutante A338V exhibió mayores actividades en el promotor temprano P97 del VPH-16 heterólogo que la del prototipo E2. Estos resultados sugieren que la mutación de Ala a Val en el aa 338 es crítica para la unión al ADN de E2 y su regulación transcripcional.Files
1471-2199-13-5.pdf
Files
(1.6 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:2170e6fcafc5500efc887c3ad1f3f955
|
1.6 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- طفرة نقطية في مجال ربط الحمض النووي لبروتين HPV -2 E2 تزيد من قدرته على ربط الحمض النووي وتعكس نشاطه التنظيمي النصي على المروج الفيروسي المبكر
- Translated title (French)
- Une mutation ponctuelle dans le domaine de liaison à l'ADN de la protéine E2 du VPH-2 augmente sa capacité de liaison à l'ADN et inverse son activité de régulation transcriptionnelle sur le promoteur précoce viral
- Translated title (Spanish)
- Una mutación puntual en el dominio de unión al ADN de la proteína E2 del VPH-2 aumenta su capacidad de unión al ADN e invierte su actividad reguladora de la transcripción en el promotor temprano viral
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2139493799
- DOI
- 10.1186/1471-2199-13-5
References
- https://openalex.org/W1512237949
- https://openalex.org/W1537495001
- https://openalex.org/W1539426772
- https://openalex.org/W1543197278
- https://openalex.org/W1672426070
- https://openalex.org/W1733587399
- https://openalex.org/W1971543205
- https://openalex.org/W1980920192
- https://openalex.org/W1999553596
- https://openalex.org/W1999931005
- https://openalex.org/W2000596495
- https://openalex.org/W2021179858
- https://openalex.org/W2034457918
- https://openalex.org/W2038692465
- https://openalex.org/W2042232078
- https://openalex.org/W2051167924
- https://openalex.org/W2055982132
- https://openalex.org/W2064296266
- https://openalex.org/W2065283382
- https://openalex.org/W2065965425
- https://openalex.org/W2078313201
- https://openalex.org/W2084336723
- https://openalex.org/W2112859230
- https://openalex.org/W2138040391
- https://openalex.org/W2140749196
- https://openalex.org/W2150981663
- https://openalex.org/W2152979497
- https://openalex.org/W2167593547
- https://openalex.org/W2167984653
- https://openalex.org/W2169985965
- https://openalex.org/W2170499910
- https://openalex.org/W2171366156
- https://openalex.org/W314887280