Published November 14, 2015
| Version v1
Publication
Open
Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for simple detection of Leishmania infection
Creators
- 1. Bangkok Christian Hospital
- 2. Chulalongkorn University
- 3. Phramongkutklao Hospital
- 4. King Chulalongkorn Memorial Hospital
- 5. Thai Red Cross Society
Description
Leishmaniasis is a neglected tropical disease that is caused by an obligate intracellular protozoan of the genus Leishmania. Recently, an increasing number of autochthonous leishmaniasis cases caused by L. martiniquensis and the novel species L. siamensis have been described in Thailand, rendering an accurate diagnosis of this disease critical. However, only a few laboratories are capable of diagnosing leishmaniasis in Thailand. To expand leishmaniasis diagnostic capabilities, we developed a simple colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique for the direct detection of Leishmania DNA. LAMP was performed for 75 min using four primers targeting the conserved region of the18S ribosomal RNA gene, and the DNA indicator used was malachite green (MG). To simulate crude samples, cultured promastigotes of L. siamensis were mixed with blood or saliva. Also, clinical samples (blood, saliva, and tissue biopsies) were obtained from patients with cutaneous leishmaniasis (CL) and visceral leishmaniasis (VL). All samples were boiled for 10 min and introduced directly into the LAMP reaction mixture without DNA purification. The use of MG resulted in an unambiguous differentiation of positive and negative controls. For L. siamensis, the detection limit was 103 parasites/mL or 2.5 parasites/tube. Saliva, tissue biopsies, and whole blood were indicative of active Leishmania infection, and their direct usages did not adversely affect the detection limit. In addition, this LAMP assay could detect DNA from multiple Leishmania species other than L. siamensis and L. martiniquensis, including L. aethiopica, L. braziliensis, L. donovani and L. tropica. The simplicity and sensitivity of LAMP in detecting active Leishmania infection could enable the rapid diagnosis of leishmaniasis, thereby facilitating the survey and control of leishmaniasis in Thailand. However, our limited number of samples warranted a further validation with a larger cohort of patients before this assay could be deployed.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
داء الليشمانيات هو مرض استوائي مهمل ناجم عن بروتوزوان إلزامي داخل الخلايا من جنس الليشمانيا. في الآونة الأخيرة، تم وصف عدد متزايد من حالات داء الليشمانيات الأصلية التي تسببها L. martiniquensis والأنواع الجديدة L. siamensis في تايلاند، مما يجعل التشخيص الدقيق لهذا المرض أمرًا بالغ الأهمية. ومع ذلك، لا يوجد سوى عدد قليل من المختبرات القادرة على تشخيص داء الليشمانيات في تايلاند. لتوسيع القدرات التشخيصية لداء الليشمانيات، قمنا بتطوير تقنية تضخيم حراري متساوي الحرارة (LAMP) بسيطة بوساطة حلقة قياس الألوان للكشف المباشر عن الحمض النووي الليشمانيا. تم إجراء LAMP لمدة 75 دقيقة باستخدام أربعة تمهيدات تستهدف المنطقة المحفوظة من جين RNA الريبوسومي 18S، وكان مؤشر الحمض النووي المستخدم هو أخضر الملاكيت (MG). لمحاكاة العينات الخام، تم خلط برومستيجوتس المستزرعة من L. siamensis مع الدم أو اللعاب. كما تم الحصول على عينات سريرية (خزعات الدم واللعاب والأنسجة) من المرضى الذين يعانون من داء الليشمانيات الجلدي (CL) وداء الليشمانيات الحشوي (VL). تم غلي جميع العينات لمدة 10 دقائق وإدخالها مباشرة في خليط تفاعل المصباح دون تنقية الحمض النووي. أدى استخدام MG إلى تمييز لا لبس فيه بين الضوابط الإيجابية والسلبية. بالنسبة لـ L. siamensis، كان حد الكشف 103 طفيليات/مل أو 2.5 طفيليات/أنبوب. كانت خزعات اللعاب والأنسجة والدم الكامل تشير إلى عدوى الليشمانيا النشطة، ولم تؤثر استخداماتها المباشرة سلبًا على حد الكشف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكشف اختبار المصباح هذا عن الحمض النووي من أنواع الليشمانيا المتعددة بخلاف L. siamensis و L. martiniquensis، بما في ذلك L. aethiopica و L. braziliensis و L. donovani و L. tropica. بساطة وحساسية المصباح في الكشف عن عدوى الليشمانيا النشطة يمكن أن تمكن من التشخيص السريع لداء الليشمانيا، وبالتالي تسهيل المسح والسيطرة على داء الليشمانيا في تايلاند. ومع ذلك، فإن عدد العينات المحدود لدينا يبرر مزيدًا من التحقق مع مجموعة أكبر من المرضى قبل نشر هذا الفحص.Translated Description (French)
La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par un protozoaire intracellulaire obligatoire du genre Leishmania. Récemment, un nombre croissant de cas de leishmaniose autochtone causée par L. martiniquensis et la nouvelle espèce L. siamensis ont été décrits en Thaïlande, ce qui rend critique un diagnostic précis de cette maladie. Cependant, seuls quelques laboratoires sont capables de diagnostiquer la leishmaniose en Thaïlande. Pour étendre les capacités de diagnostic de la leishmaniose, nous avons développé une technique simple d'amplification isotherme colorimétrique à médiation par boucle (LAMP) pour la détection directe de l'ADN de Leishmania. LA LAMPE a été réalisée pendant 75 min en utilisant quatre amorces ciblant la région conservée du gène de l'ARN ribosomique 18S, et l'indicateur d'ADN utilisé était le vert malachite (MG). Pour simuler des échantillons bruts, des promastigotes cultivés de L. siamensis ont été mélangés avec du sang ou de la salive. En outre, des échantillons cliniques (sang, salive et biopsies tissulaires) ont été obtenus chez des patients atteints de leishmaniose cutanée (CL) et de leishmaniose viscérale (VL). Tous les échantillons ont été bouillis pendant 10 min et introduits directement dans le mélange réactionnel de la LAMPE sans purification de l'ADN. L'utilisation de MG a entraîné une différenciation sans ambiguïté des contrôles positifs et négatifs. Pour L. siamensis, la limite de détection était de 103 parasites/mL ou 2,5 parasites/tube. La salive, les biopsies tissulaires et le sang total étaient indicatifs d'une infection active à Leishmania, et leur utilisation directe n'a pas affecté négativement la limite de détection. De plus, ce test LAMP a pu détecter l'ADN de plusieurs espèces de Leishmania autres que L. siamensis et L. martiniquensis, y compris L. aethiopica, L. braziliensis, L. donovani et L. tropica. La simplicité et la sensibilité de LAMP dans la détection de l'infection active à Leishmania pourraient permettre le diagnostic rapide de la leishmaniose, facilitant ainsi l'enquête et le contrôle de la leishmaniose en Thaïlande. Cependant, notre nombre limité d'échantillons justifiait une validation supplémentaire auprès d'une plus grande cohorte de patients avant que ce test puisse être déployé.Translated Description (Spanish)
La leishmaniasis es una enfermedad tropical desatendida causada por un protozoo intracelular obligado del género Leishmania. Recientemente, se ha descrito en Tailandia un número creciente de casos de leishmaniasis autóctona causados por L. martiniquensis y la nueva especie L. siamensis, lo que hace que un diagnóstico preciso de esta enfermedad sea crítico. Sin embargo, solo unos pocos laboratorios son capaces de diagnosticar la leishmaniasis en Tailandia. Para ampliar las capacidades de diagnóstico de la leishmaniasis, desarrollamos una técnica simple de amplificación isotérmica mediada por bucle colorimétrico (LAMP) para la detección directa del ADN de Leishmania. LAMP se realizó durante 75 min utilizando cuatro cebadores dirigidos a la región conservada del gen de ARN ribosómico 18S, y el indicador de ADN utilizado fue verde malaquita (MG). Para simular muestras crudas, se mezclaron promastigotes cultivados de L. siamensis con sangre o saliva. Además, se obtuvieron muestras clínicas (sangre, saliva y biopsias de tejidos) de pacientes con leishmaniasis cutánea (CL) y leishmaniasis visceral (VL). Todas las muestras se hirvieron durante 10 min y se introdujeron directamente en la mezcla de reacción de LAMP sin purificación de ADN. El uso de MG resultó en una diferenciación inequívoca de controles positivos y negativos. Para L. siamensis, el límite de detección fue de 103 parásitos/ml o 2,5 parásitos/tubo. La saliva, las biopsias de tejidos y la sangre completa fueron indicativas de infección activa por Leishmania, y sus usos directos no afectaron negativamente el límite de detección. Además, este ensayo LAMP podría detectar ADN de múltiples especies de Leishmania distintas de L. siamensis y L. martiniquensis, incluyendo L. aethiopica, L. braziliensis, L. donovani y L. tropica. La simplicidad y sensibilidad de LAMP en la detección de la infección activa por Leishmania podría permitir el diagnóstico rápido de la leishmaniasis, facilitando así el estudio y control de la leishmaniasis en Tailandia. Sin embargo, nuestro número limitado de muestras justificó una validación adicional con una cohorte más grande de pacientes antes de que se pudiera implementar este ensayo.Files
s13071-015-1202-x.pdf
Files
(856.8 kB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:b65ef13054c756e00c3556f34a1a2521
|
856.8 kB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تطوير تضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) للكشف البسيط عن عدوى الليشمانيا
- Translated title (French)
- Développement de l'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) pour la détection simple de l'infection à Leishmania
- Translated title (Spanish)
- Desarrollo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para la detección simple de la infección por Leishmania
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2177590639
- DOI
- 10.1186/s13071-015-1202-x
References
- https://openalex.org/W1494804630
- https://openalex.org/W1661490723
- https://openalex.org/W1760964739
- https://openalex.org/W1966871230
- https://openalex.org/W1973500483
- https://openalex.org/W1975565305
- https://openalex.org/W1982360364
- https://openalex.org/W1983916351
- https://openalex.org/W2021031313
- https://openalex.org/W2022367345
- https://openalex.org/W2029532692
- https://openalex.org/W2029618039
- https://openalex.org/W2031744074
- https://openalex.org/W2032053228
- https://openalex.org/W2037047153
- https://openalex.org/W2041411206
- https://openalex.org/W2041712915
- https://openalex.org/W2053662296
- https://openalex.org/W2054304937
- https://openalex.org/W2057327385
- https://openalex.org/W2059214261
- https://openalex.org/W2065098811
- https://openalex.org/W2066385972
- https://openalex.org/W2066954635
- https://openalex.org/W2073907484
- https://openalex.org/W2085839105
- https://openalex.org/W2087262141
- https://openalex.org/W2098803611
- https://openalex.org/W2104145751
- https://openalex.org/W2105275554
- https://openalex.org/W2106477955
- https://openalex.org/W2110508689
- https://openalex.org/W2119075931
- https://openalex.org/W2121696866
- https://openalex.org/W2132199935
- https://openalex.org/W2135086664
- https://openalex.org/W2135218835
- https://openalex.org/W2136115746
- https://openalex.org/W2141146278
- https://openalex.org/W2142002667
- https://openalex.org/W2155283295
- https://openalex.org/W2159416923
- https://openalex.org/W2167835414
- https://openalex.org/W2168952903
- https://openalex.org/W2398889103
- https://openalex.org/W2404548598
- https://openalex.org/W2415395588
- https://openalex.org/W2416617891
- https://openalex.org/W4211078476
- https://openalex.org/W81757823
- https://openalex.org/W89695407