Published June 10, 2015 | Version v1
Publication Open

Factors influencing somatic embryogenesis, regeneration, and Agrobacterium-mediated transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz) cultivar TME14

Creators

  • 1. International Institute of Tropical Agriculture

Description

Routine production of large numbers of transgenic plants is required to fully exploit advances in cassava biotechnology and support development of improved germplasm for deployment to farmers. This article describes an improved, high-efficiency transformation protocol for recalcitrant cassava cultivar TME14 preferred in Africa. Factors that favor production of friable embryogenic calli (FEC) were found to be use of DKW medium, crushing of organized embryogenic structures (OES) through 1-2 mm sized metal wire mesh, washing of crushed OES tissues and short exposure of tyrosine to somatic embryos; and transformation efficiency was enhanced by use of low Agrobacterium density during co-cultivation, co-centrifugation of friable embryogenic calli (FEC) with Agrobacterium, germination of paramomycin resistant somatic embryos on medium containing BAP with gradual increase in concentration and variations of the frequency of subculture of cotyledons. By applying the optimized parameters, FEC were produced for cassava cultivar TME14 and transformed using Agrobacterium strain LBA4404 harboring the binary vector pCAMBIA2301. About 70–80 independent transgenic lines per ml settled cell volume (SCV) of friable embryogenic calli were regenerated on selective medium. Histochemical GUS assays confirmed the expression of gusA gene in transformed calli, somatic embryos and transgenic plants. The presence and integration of the gusA gene were confirmed by PCR and Southern blot analysis, respectively. RT-PCR analysis of transgenic plants confirmed the expression of gusA gene. This protocol demonstrates significantly enhanced transformation efficiency over existing cassava transformation protocols and could become a powerful tool for functional genomics and transferring new traits into cassava.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

هناك حاجة إلى الإنتاج الروتيني لأعداد كبيرة من النباتات المعدلة وراثيًا لاستغلال التقدم في التكنولوجيا الحيوية للكسافا بشكل كامل ودعم تطوير الجبلة الوراثية المحسنة لنشرها على المزارعين. تصف هذه المقالة بروتوكول تحويل محسّن وعالي الكفاءة لصنف المنيهوت TME14 المفضل في إفريقيا. تم العثور على العوامل التي تفضل إنتاج كالي المضغي القابل للتفتيت (FEC) هي استخدام وسط DKW، وسحق الهياكل الجنينية المنظمة (OES) من خلال شبكة سلكية معدنية بحجم 1-2 مم، وغسل أنسجة OES المسحوقة والتعرض القصير للتيروزين للأجنة الجسدية ؛ وتم تعزيز كفاءة التحول من خلال استخدام كثافة منخفضة من البكتيريا الزراعية أثناء الزراعة المشتركة، والطرد المشترك للكالي المضغي القابل للتفتيت (FEC) مع Agrobacterium، وإنبات الأجنة الجسدية المقاومة للبارامومايسين على وسط يحتوي على BAP مع زيادة تدريجية في التركيز والاختلافات في تواتر الثقافة الفرعية للكوتيليدونات. من خلال تطبيق المعلمات المحسنة، تم إنتاج FEC لصنف المنيهوت TME14 وتحويله باستخدام سلالة Agrobacterium LBA4404 التي تأوي المتجه الثنائي pCAMBIA2301. تم تجديد حوالي 70–80 خطًا معدلًا وراثيًا مستقلًا لكل مل من حجم الخلايا المستقرة (SCV) من الكالي المضغي القابل للتفتيت على وسط انتقائي. أكدت فحوصات GUS الكيميائية النسيجية التعبير عن جين gusA في الكالي المحول والأجنة الجسدية والنباتات المعدلة وراثيًا. تم تأكيد وجود وتكامل جين gusA من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليل البقعة الجنوبية، على التوالي. أكد تحليل RT - PCR للنباتات المعدلة وراثيًا التعبير عن جين gusA. يوضح هذا البروتوكول كفاءة تحويل معززة بشكل كبير مقارنة ببروتوكولات تحويل الكسافا الحالية ويمكن أن يصبح أداة قوية لعلم الجينوم الوظيفي ونقل سمات جديدة إلى الكسافا.

Translated Description (French)

La production de routine d'un grand nombre de plantes transgéniques est nécessaire pour exploiter pleinement les progrès de la biotechnologie du manioc et soutenir le développement d'un germoplasme amélioré à déployer chez les agriculteurs. Cet article décrit un protocole de transformation amélioré et à haut rendement pour le cultivar de manioc récalcitrant TME14 préféré en Afrique. Les facteurs qui favorisent la production de cals embryogéniques friables (FEC) se sont révélés être l'utilisation d'un milieu DKW, l'écrasement de structures embryogéniques organisées (OES) à travers un treillis métallique de 1 à 2 mm, le lavage des tissus OES écrasés et une courte exposition de la tyrosine aux embryons somatiques ; et l'efficacité de la transformation a été améliorée par l'utilisation d'une faible densité d'Agrobacterium pendant la co-culture, la co-centrifugation de cals embryogéniques friables (FEC) avec Agrobacterium, la germination d'embryons somatiques résistants à la paramomycine sur un milieu contenant de la BAP avec une augmentation progressive de la concentration et des variations de la fréquence de sous-culture des cotylédons. En appliquant les paramètres optimisés, les FEC ont été produites pour le cultivar de manioc TME14 et transformées à l'aide de la souche Agrobacterium LBA4404 abritant le vecteur binaire pCAMBIA2301. Environ 70–80 lignées transgéniques indépendantes par ml de volume cellulaire stabilisé (SCV) de calles embryogènes friables ont été régénérées sur milieu sélectif. Des dosages histochimiques de GUS ont confirmé l'expression du gène gusA dans des cals transformés, des embryons somatiques et des plantes transgéniques. La présence et l'intégration du gène gusA ont été confirmées par PCR et par analyse par Southern blot, respectivement. L'analyse RT-PCR des plantes transgéniques a confirmé l'expression du gène gusA. Ce protocole démontre une efficacité de transformation considérablement améliorée par rapport aux protocoles de transformation du manioc existants et pourrait devenir un outil puissant pour la génomique fonctionnelle et le transfert de nouveaux traits dans le manioc.

Translated Description (Spanish)

Se requiere la producción rutinaria de un gran número de plantas transgénicas para aprovechar al máximo los avances en la biotecnología de la yuca y apoyar el desarrollo de germoplasma mejorado para su despliegue entre los agricultores. Este artículo describe un protocolo de transformación mejorado y de alta eficiencia para el cultivar de yuca recalcitrante TME14 preferido en África. Se encontró que los factores que favorecen la producción de callos embriogénicos friables (FEC) son el uso de medio DKW, la trituración de estructuras embriogénicas organizadas (OES) a través de una malla de alambre metálico de 1-2 mm de tamaño, el lavado de tejidos OES triturados y la corta exposición de tirosina a embriones somáticos; y la eficiencia de transformación se mejoró mediante el uso de baja densidad de Agrobacterium durante el cocultivo, la cocentrifugación de callos embriogénicos friables (FEC) con Agrobacterium, la germinación de embriones somáticos resistentes a paramomicina en medio que contiene BAP con aumento gradual de la concentración y variaciones de la frecuencia de subcultivo de cotiledones. Al aplicar los parámetros optimizados, se produjeron FEC para el cultivar de yuca TME14 y se transformaron utilizando la cepa LBA4404 de Agrobacterium que alberga el vector binario pCAMBIA2301. Se regeneraron alrededor de 70–80 líneas transgénicas independientes por ml de volumen celular sedimentado (SCV) de callos embriogénicos friables en medio selectivo. Los ensayos histoquímicos de GUS confirmaron la expresión del gen gusA en callos transformados, embriones somáticos y plantas transgénicas. La presencia e integración del gen gusA se confirmaron mediante PCR y análisis de transferencia Southern, respectivamente. El análisis de RT-PCR de plantas transgénicas confirmó la expresión del gen gusA. Este protocolo demuestra una eficiencia de transformación significativamente mejorada con respecto a los protocolos de transformación de yuca existentes y podría convertirse en una poderosa herramienta para la genómica funcional y la transferencia de nuevos rasgos a la yuca.

Files

pdf.pdf

Files (1.5 MB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:b014c41b4c1ef7f4d9b751ce61cbd26f
1.5 MB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
العوامل التي تؤثر على تكوين الجنين الجسدي، والتجديد، والتحول بوساطة Agrobacterium للكسافا (Manihot esculenta Crantz) صنف TME14
Translated title (French)
Facteurs influençant l'embryogenèse somatique, la régénération et la transformation médiée par Agrobacterium du cultivar de manioc (Manihot esculenta Crantz) TME14
Translated title (Spanish)
Factores que influyen en la embriogénesis somática, la regeneración y la transformación mediada por Agrobacterium del cultivar TME14 de yuca (Manihot esculenta Crantz)

Identifiers

Other
https://openalex.org/W1481691650
DOI
10.3389/fpls.2015.00411

Is supplement to
https://openalex.org/W2953049366 (Other)
https://openalex.org/W2807566437 (Other)
https://openalex.org/W2378829992 (Other)
https://openalex.org/W2370333474 (Other)
https://openalex.org/W2358348811 (Other)
https://openalex.org/W221555767 (Other)
https://openalex.org/W2098647701 (Other)
https://openalex.org/W2061302987 (Other)
https://openalex.org/W2044522300 (Other)
https://openalex.org/W1964951057 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
Kenya

References

  • https://openalex.org/W1510880140
  • https://openalex.org/W1530204343
  • https://openalex.org/W1574233575
  • https://openalex.org/W1969239589
  • https://openalex.org/W1972262510
  • https://openalex.org/W1972659721
  • https://openalex.org/W1976391864
  • https://openalex.org/W1977766787
  • https://openalex.org/W1980719911
  • https://openalex.org/W1984001443
  • https://openalex.org/W1986867666
  • https://openalex.org/W1992255794
  • https://openalex.org/W1994035663
  • https://openalex.org/W2015553172
  • https://openalex.org/W2018177712
  • https://openalex.org/W2024556021
  • https://openalex.org/W2029476089
  • https://openalex.org/W2039706808
  • https://openalex.org/W2042623986
  • https://openalex.org/W2045309336
  • https://openalex.org/W2045439285
  • https://openalex.org/W2056706019
  • https://openalex.org/W2073764507
  • https://openalex.org/W2078044364
  • https://openalex.org/W2078834701
  • https://openalex.org/W2082004162
  • https://openalex.org/W2087660830
  • https://openalex.org/W2093767719
  • https://openalex.org/W2105551788
  • https://openalex.org/W2110380226
  • https://openalex.org/W2123438922
  • https://openalex.org/W2124109750
  • https://openalex.org/W2137238549
  • https://openalex.org/W2138076054
  • https://openalex.org/W2158650493
  • https://openalex.org/W235402724
  • https://openalex.org/W2469161413
  • https://openalex.org/W4231655847