Published February 21, 2015
| Version v1
Publication
Open
Quantification of Plasmodium-host protein interactions on intact, unmodified erythrocytes by back-scattering interferometry
Creators
- 1. Mahidol University
- 2. Wellcome Sanger Institute
- 3. Vanderbilt University
Description
Invasion of host erythrocytes by Plasmodium falciparum is central to the pathogenesis of malaria. Invasion involves recognition events between erythrocyte receptors and ligands on the merozoite, the invasive blood form of the parasite. Identifying and characterizing host-parasite interactions is impeded by the biochemical challenges of working with membrane-embedded glycoprotein receptors. For example, the interaction between P. falciparum erythrocyte binding antigen 175 (PfEBA175) and glycophorin A (GYPA) depends on post-translational modifications that are not easily added in recombinant expression systems, and the use of native GYPA is limited by the hydrophobic transmembrane region, making it difficult to biochemically manipulate. It would, therefore, be desirable to perform quantitative binding assays with receptors embedded within the membranes of intact human erythrocytes.The extracellular region of GYPA was over-expressed as a soluble protein in HEK293E cells. This protein was characterized, sialylated and evaluated for binding to the PfEBA175 protein. The label-free and free-solution assay, backscattering interferometry (BSI), was used to perform binding assays of two well-characterized P. falciparum invasion ligands to intact unmodified human erythrocytes.Findings indicate that the post-translational modifications present on native GYPA are required for it to bind recombinant PfEBA175 and that these modifications cannot be recapitulated in vitro using mammalian overexpression methods. Here, BSI was used to obtain quantitative, high fidelity interaction determinations on intact, unmodified erythrocytes. Using BSI and purified recombinant proteins constituting the entire ectodomains of the P. falciparum merozoite ligands PfEBA175 and PfRH5, K Ds of 1.1 μM and 50 nM were measured for the PfRH5-BSG and PfEBA175-GYPA interactions, respectively, in good agreement with previous biophysical measurements of these interactions.These results demonstrate that BSI can be used to detect and quantify the interactions of two merozoite invasion ligands with their receptors on intact human erythrocytes. BSI assays were performed on unlabelled, free-solution proteins in their native environment, requiring only nanomoles of recombinant protein. This study suggests that BSI can be used to investigate host-parasite protein interactions without the limitations of other assay platforms, and therefore represents a valuable new method to investigate the molecular mechanisms involved in erythrocyte invasion by P. falciparum.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
يعد غزو كريات الدم الحمراء المضيفة بواسطة المتصورة المنجلية أمرًا أساسيًا في التسبب في الملاريا. يتضمن الغزو أحداث التعرف بين مستقبلات كريات الدم الحمراء والروابط على الميروزايت، وهو شكل الدم الغازي للطفيلي. يتم إعاقة تحديد وتوصيف تفاعلات المضيف والطفيليات من خلال التحديات البيوكيميائية للعمل مع مستقبلات البروتين السكري المضمنة في الغشاء. على سبيل المثال، يعتمد التفاعل بين المستضد الرابط لخلايا الدم الحمراء المنجلية 175 (PfEBA175) والجليكوفورين A (GYPA) على تعديلات ما بعد الترجمة التي لا يمكن إضافتها بسهولة في أنظمة التعبير المؤتلف، ويقتصر استخدام GYPA الأصلي على المنطقة عبر الغشاء الكارهة للماء، مما يجعل من الصعب التلاعب بها كيميائيًا. لذلك، سيكون من المستحسن إجراء فحوصات الربط الكمي مع المستقبلات المضمنة داخل أغشية كريات الدم الحمراء البشرية السليمة. تم التعبير عن المنطقة خارج الخلية من GYPA بشكل مفرط كبروتين قابل للذوبان في خلايا HEK293E. تم تمييز هذا البروتين ومعالجته بالسياليل وتقييمه للارتباط ببروتين PfEBA175. تم استخدام المقايسة الخالية من الملصقات والحل الحر، قياس التداخل بالتشتت العكسي (BSI)، لإجراء مقايسات ربط لاثنين من روابط غزو P. falciparum المميزة جيدًا لكريات الدم الحمراء البشرية غير المعدلة السليمة. تشير النتائج إلى أن تعديلات ما بعد الترجمة الموجودة على GYPA الأصلية مطلوبة لربط PfEBA175 المؤتلف وأنه لا يمكن تلخيص هذه التعديلات في المختبر باستخدام طرق التعبير المفرط للثدييات. هنا، تم استخدام BSI للحصول على قرارات تفاعل كمية عالية الدقة على كريات الدم الحمراء السليمة وغير المعدلة. باستخدام BSI والبروتينات المؤتلفة المنقاة التي تشكل النطاقات الخارجية الكاملة لرابطات P. falciparum merozoite PfEBA175 و PfRH5، تم قياس K Ds من 1.1 ميكرومتر و 50 نانومتر لتفاعلات PfRH5 - BSG و PfEBA175 - GYPA، على التوالي، بما يتفق جيدًا مع القياسات الفيزيائية الحيوية السابقة لهذه التفاعلات. توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام BSI لاكتشاف وقياس تفاعلات رابطتين لغزو الميروزيت مع مستقبلاتهما على كريات الدم الحمراء البشرية السليمة. تم إجراء فحوصات BSI على البروتينات غير الموسومة والحرة الحل في بيئتها الأصلية، والتي تتطلب فقط جزيئات نانوية من البروتين المؤتلف. تشير هذه الدراسة إلى أنه يمكن استخدام BSI للتحقيق في تفاعلات البروتين بين المضيف والطفيلي دون قيود منصات الفحص الأخرى، وبالتالي يمثل طريقة جديدة قيمة للتحقيق في الآليات الجزيئية المشاركة في غزو كريات الدم الحمراء بواسطة P. falciparum.Translated Description (French)
L'invasion des érythrocytes hôtes par Plasmodium falciparum est au cœur de la pathogenèse du paludisme. L'invasion implique des événements de reconnaissance entre les récepteurs érythrocytaires et les ligands sur le mérozoïte, la forme sanguine invasive du parasite. L'identification et la caractérisation des interactions hôte-parasite sont entravées par les défis biochimiques liés au travail avec les récepteurs de glycoprotéines intégrés dans la membrane. Par exemple, l'interaction entre l'antigène 175 de liaison aux érythrocytes de P. falciparum (PfEBA175) et la glycophorine A (GYPA) dépend de modifications post-traductionnelles qui ne sont pas facilement ajoutées dans les systèmes d'expression recombinants, et l'utilisation de la GYPA native est limitée par la région transmembranaire hydrophobe, ce qui la rend difficile à manipuler biochimiquement. Il serait donc souhaitable d'effectuer des essais de liaison quantitative avec des récepteurs intégrés dans les membranes d'érythrocytes humains intacts. La région extracellulaire de GYPA a été surexprimée en tant que protéine soluble dans les cellules HEK293E. Cette protéine a été caractérisée, sialylée et évaluée pour la liaison à la protéine PfEBA175. Le test de rétrodiffusion interférométrique (BSI), sans marqueur et en solution libre, a été utilisé pour effectuer des tests de liaison de deux ligands d'invasion de P. falciparum bien caractérisés à des érythrocytes humains intacts non modifiés. Les résultats indiquent que les modifications post-traductionnelles présentes sur le GYPA natif sont nécessaires pour qu'il se lie au PfEBA175 recombinant et que ces modifications ne peuvent pas être récapitulées in vitro à l'aide de méthodes de surexpression mammaliennes. Ici, le BSI a été utilisé pour obtenir des déterminations quantitatives d'interaction haute fidélité sur des érythrocytes intacts et non modifiés. En utilisant BSI et des protéines recombinantes purifiées constituant l'ensemble des ectodomaines des ligands mérozoïtes de P. falciparum PfEBA175 et PfRH5, des K D de 1,1 μM et 50 nM ont été mesurés pour les interactions PfRH5-BSG et PfEBA175-GYPA, respectivement, en bon accord avec les mesures biophysiques antérieures de ces interactions. Ces résultats démontrent que BSI peut être utilisé pour détecter et quantifier les interactions de deux ligands d'invasion mérozoïte avec leurs récepteurs sur des érythrocytes humains intacts. Les tests BSI ont été effectués sur des protéines en solution libre non marquées dans leur environnement natif, ne nécessitant que des nanomoles de protéine recombinante. Cette étude suggère que le BSI peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-protéine parasite sans les limitations d'autres plates-formes de dosage, et représente donc une nouvelle méthode précieuse pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l'invasion des érythrocytes par P. falciparum.Translated Description (Spanish)
La invasión de los eritrocitos del huésped por Plasmodium falciparum es fundamental para la patogénesis de la malaria. La invasión implica eventos de reconocimiento entre los receptores de eritrocitos y los ligandos en el merozoito, la forma sanguínea invasiva del parásito. La identificación y caracterización de las interacciones huésped-parásito se ve obstaculizada por los desafíos bioquímicos de trabajar con receptores de glicoproteínas incrustados en la membrana. Por ejemplo, la interacción entre el antígeno de unión a eritrocitos de P. falciparum 175 (PfEBA175) y la glicoforina A (GYPA) depende de modificaciones postraduccionales que no se agregan fácilmente en los sistemas de expresión recombinante, y el uso de GYPA nativo está limitado por la región transmembrana hidrófoba, lo que dificulta su manipulación bioquímica. Por lo tanto, sería deseable realizar ensayos de unión cuantitativos con receptores incrustados dentro de las membranas de eritrocitos humanos intactos. La región extracelular de GYPA se sobreexpresó como una proteína soluble en células HEK293E. Esta proteína se caracterizó, sialiló y evaluó para determinar la unión a la proteína PfEBA175. El ensayo de solución libre y libre, interferometría de retrodispersión (BSI), se utilizó para realizar ensayos de unión de dos ligandos de invasión de P. falciparum bien caracterizados a eritrocitos humanos intactos no modificados. Los hallazgos indican que las modificaciones postraduccionales presentes en GYPA nativo son necesarias para que se una a PfEBA175 recombinante y que estas modificaciones no pueden recapitularse in vitro utilizando métodos de sobreexpresión de mamíferos. Aquí, se utilizó BSI para obtener determinaciones cuantitativas de interacción de alta fidelidad en eritrocitos intactos y no modificados. Usando BSI y proteínas recombinantes purificadas que constituyen los ectodominios completos de los ligandos de merozoitos de P. falciparum PfEBA175 y PfRH5, se midieron K Ds de 1.1 μM y 50 nM para las interacciones PfRH5-BSG y PfEBA175-GYPA, respectivamente, en buen acuerdo con las mediciones biofísicas previas de estas interacciones. Estos resultados demuestran que BSI se puede usar para detectar y cuantificar las interacciones de dos ligandos de invasión de merozoitos con sus receptores en eritrocitos humanos intactos. Los ensayos de BSI se realizaron en proteínas de solución libre no marcadas en su entorno nativo, requiriendo solo nanomoles de proteína recombinante. Este estudio sugiere que el BSI se puede utilizar para investigar las interacciones de la proteína huésped-parásito sin las limitaciones de otras plataformas de ensayo y, por lo tanto, representa un nuevo método valioso para investigar los mecanismos moleculares involucrados en la invasión de eritrocitos por P. falciparum.Files
s12936-015-0553-2.pdf
Files
(1.6 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:5eb409b2955d04a0d329e39b793fa3cf
|
1.6 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- القياس الكمي لتفاعلات بروتين البلازموديوم المضيف على كريات الدم الحمراء السليمة وغير المعدلة عن طريق قياس التداخل المتشتت عكسيًا
- Translated title (French)
- Quantification des interactions plasmodium-protéine hôte sur des érythrocytes intacts et non modifiés par interférométrie de rétrodiffusion
- Translated title (Spanish)
- Cuantificación de las interacciones entre Plasmodium y la proteína huésped en eritrocitos intactos y no modificados mediante interferometría de retrodispersión
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2129237384
- DOI
- 10.1186/s12936-015-0553-2
References
- https://openalex.org/W1530737864
- https://openalex.org/W1798528947
- https://openalex.org/W1891682296
- https://openalex.org/W1964149115
- https://openalex.org/W1975881900
- https://openalex.org/W1985878579
- https://openalex.org/W1992084968
- https://openalex.org/W1993330131
- https://openalex.org/W1994031108
- https://openalex.org/W1996127102
- https://openalex.org/W1999539381
- https://openalex.org/W2005811826
- https://openalex.org/W2007732687
- https://openalex.org/W2014556797
- https://openalex.org/W2026483075
- https://openalex.org/W2034395399
- https://openalex.org/W2039735909
- https://openalex.org/W2048295316
- https://openalex.org/W2049237667
- https://openalex.org/W2049551663
- https://openalex.org/W2057569983
- https://openalex.org/W2068045057
- https://openalex.org/W2080367104
- https://openalex.org/W2081030911
- https://openalex.org/W2083126580
- https://openalex.org/W2095554063
- https://openalex.org/W2119376399
- https://openalex.org/W2130314959
- https://openalex.org/W2135162400
- https://openalex.org/W2139195186
- https://openalex.org/W2141286425
- https://openalex.org/W2144489331
- https://openalex.org/W2150488056
- https://openalex.org/W2158684589
- https://openalex.org/W2317128923
- https://openalex.org/W2325837173
- https://openalex.org/W2440572882