Published May 18, 2012 | Version v1
Publication Open

Development and Validation of Burkholderia pseudomallei-Specific Real-Time PCR Assays for Clinical, Environmental or Forensic Detection Applications

Creators

  • 1. Menzies School of Health Research
  • 2. Northern Arizona University
  • 3. Translational Genomics Research Institute
  • 4. Centers for Disease Control and Prevention
  • 5. Mahidol Oxford Tropical Medicine Research Unit
  • 6. Mahidol University
  • 7. James Cook University
  • 8. Genome Institute of Singapore
  • 9. University of Cambridge

Description

The bacterium Burkholderia pseudomallei causes melioidosis, a rare but serious illness that can be fatal if untreated or misdiagnosed. Species-specific PCR assays provide a technically simple method for differentiating B. pseudomallei from near-neighbor species. However, substantial genetic diversity and high levels of recombination within this species reduce the likelihood that molecular signatures will differentiate all B. pseudomallei from other Burkholderiaceae. Currently available molecular assays for B. pseudomallei detection lack rigorous validation across large in silico datasets and isolate collections to test for specificity, and none have been subjected to stringent quality control criteria (accuracy, precision, selectivity, limit of quantitation (LoQ), limit of detection (LoD), linearity, ruggedness and robustness) to determine their suitability for environmental, clinical or forensic investigations. In this study, we developed two novel B. pseudomallei specific assays, 122018 and 266152, using a dual-probe approach to differentiate B. pseudomallei from B. thailandensis, B. oklahomensis and B. thailandensis-like species; other species failed to amplify. Species specificity was validated across a large DNA panel (>2,300 samples) comprising Burkholderia spp. and non-Burkholderia bacterial and fungal species of clinical and environmental relevance. Comparison of assay specificity to two previously published B. pseudomallei-specific assays, BurkDiff and TTS1, demonstrated comparable performance of all assays, providing between 99.7 and 100% specificity against our isolate panel. Last, we subjected 122018 and 266152 to rigorous quality control analyses, thus providing quantitative limits of assay performance. Using B. pseudomallei as a model, our study provides a framework for comprehensive quantitative validation of molecular assays and provides additional, highly validated B. pseudomallei assays for the scientific research community.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

تسبب بكتيريا Burkholderia pseudomallei داء الميلويد، وهو مرض نادر ولكنه خطير يمكن أن يكون مميتًا إذا لم يتم علاجه أو تشخيصه بشكل خاطئ. توفر فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بالأنواع طريقة بسيطة تقنيًا للتمييز بين B. pseudomallei والأنواع القريبة من الجيران. ومع ذلك، فإن التنوع الجيني الكبير والمستويات العالية من إعادة التركيب داخل هذا النوع تقلل من احتمال أن تميز التواقيع الجزيئية جميع فصيلة البوركهولدريا عن غيرها من فصيلة البوركهولدريا. تفتقر المقايسات الجزيئية المتاحة حاليًا للكشف عن B. pseudomallei إلى التحقق الصارم عبر مجموعات بيانات سيليكو كبيرة وعزل المجموعات لاختبار الخصوصية، ولم يخضع أي منها لمعايير صارمة لمراقبة الجودة (الدقة والدقة والانتقائية وحدود القياس (LoQ) وحدود الكشف (LoD) والخطية والمتانة والمتانة) لتحديد مدى ملاءمتها للتحقيقات البيئية أو السريرية أو الجنائية. في هذه الدراسة، طورنا نوعين جديدين من المقايسات الخاصة بـ B. pseudomallei، 122018 و 266152، باستخدام نهج المسبار المزدوج للتمييز بين B. pseudomallei و B. thailandensis و B. oklahomensis و B. thailandensis ؛ فشلت الأنواع الأخرى في التضخيم. تم التحقق من صحة خصوصية الأنواع عبر لوحة كبيرة من الحمض النووي (>2300 عينة) تضم أنواع البوركهولدريا البكتيرية وغير البوركهولدريا البكتيرية والفطرية ذات الصلة السريرية والبيئية. أظهرت مقارنة خصوصية الفحص باثنين من المقايسات الخاصة بـ B. pseudomallei المنشورة سابقًا، BurkDiff و TTS1، أداءً قابلاً للمقارنة لجميع المقايسات، مما يوفر خصوصية بين 99.7 و 100 ٪ مقابل لوحة العزل الخاصة بنا. أخيرًا، أخضعنا 122018 و 266152 لتحليلات صارمة لمراقبة الجودة، وبالتالي توفير حدود كمية لأداء الفحص. باستخدام B. pseudomallei كنموذج، توفر دراستنا إطارًا للتحقق الكمي الشامل من المقايسات الجزيئية وتوفر مقايسات B. pseudomallei إضافية ومثبتة للغاية لمجتمع البحث العلمي.

Translated Description (French)

La bactérie Burkholderia pseudomallei provoque la mélioïdose, une maladie rare mais grave qui peut être mortelle si elle n'est pas traitée ou mal diagnostiquée. Les tests PCR spécifiques aux espèces fournissent une méthode techniquement simple pour différencier B. pseudomallei des espèces proches voisines. Cependant, une diversité génétique importante et des niveaux élevés de recombinaison au sein de cette espèce réduisent la probabilité que les signatures moléculaires différencient tous les B. pseudomallei des autres Burkholderiaceae. Les tests moléculaires actuellement disponibles pour la détection de B. pseudomallei manquent de validation rigoureuse dans de grands ensembles de données in silico et des collections d'isolats pour tester la spécificité, et aucun n'a été soumis à des critères de contrôle de qualité stricts (exactitude, précision, sélectivité, limite de quantification (LoQ), limite de détection (LoD), linéarité, robustesse et robustesse) pour déterminer leur adéquation aux enquêtes environnementales, cliniques ou médico-légales. Dans cette étude, nous avons développé deux nouveaux essais spécifiques de B. pseudomallei, 122018 et 266152, en utilisant une approche à double sonde pour différencier B. pseudomallei de B. thailandensis, B. oklahomensis et B. thailandensis. espèces semblables ; d'autres espèces n'ont pas réussi à amplifier. La spécificité de l'espèce a été validée sur un large panel d'ADN (>2 300 échantillons) comprenant Burkholderia spp. et des espèces bactériennes et fongiques non Burkholderia d'importance clinique et environnementale. La comparaison de la spécificité du test à deux tests spécifiques de B. pseudomallei publiés précédemment, BurkDiff et TTS1, a démontré des performances comparables de tous les tests, fournissant entre 99,7 et 100 % de spécificité par rapport à notre panel d'isolats. Enfin, nous avons soumis 122018 et 266152 à des analyses de contrôle qualité rigoureuses, fournissant ainsi des limites quantitatives de performance de dosage. En utilisant B. pseudomallei comme modèle, notre étude fournit un cadre pour la validation quantitative complète des dosages moléculaires et fournit des dosages supplémentaires de B. pseudomallei hautement validés pour la communauté de la recherche scientifique.

Translated Description (Spanish)

La bacteria Burkholderia pseudomallei causa melioidosis, una enfermedad rara pero grave que puede ser mortal si no se trata o se diagnostica erróneamente. Los ensayos de PCR específicos de especie proporcionan un método técnicamente simple para diferenciar B. pseudomallei de especies cercanas. Sin embargo, la diversidad genética sustancial y los altos niveles de recombinación dentro de esta especie reducen la probabilidad de que las firmas moleculares diferencien a todas las B. pseudomallei de otras Burkholderiaceae. Los ensayos moleculares actualmente disponibles para la detección de B. pseudomallei carecen de una validación rigurosa en grandes conjuntos de datos in silico y colecciones aisladas para probar su especificidad, y ninguno ha sido sometido a estrictos criterios de control de calidad (precisión, precisión, selectividad, límite de cuantificación (LoQ), límite de detección (LoD), linealidad, robustez y robustez) para determinar su idoneidad para investigaciones ambientales, clínicas o forenses. En este estudio, desarrollamos dos nuevos ensayos específicos de B. pseudomallei, 122018 y 266152, utilizando un enfoque de doble sonda para diferenciar B. pseudomallei de B. thailandensis, B. oklahomensis y especies similares a B. thailandensis; otras especies no lograron amplificarse. La especificidad de la especie se validó a través de un gran panel de ADN (>2300 muestras) que comprende especies bacterianas y fúngicas de Burkholderia spp. y no-Burkholderia de relevancia clínica y ambiental. La comparación de la especificidad del ensayo con dos ensayos específicos de B. pseudomallei publicados anteriormente, BurkDiff y TTS1, demostró un rendimiento comparable de todos los ensayos, proporcionando entre 99.7 y 100% de especificidad contra nuestro panel de aislados. Por último, sometimos 122018 y 266152 a rigurosos análisis de control de calidad, proporcionando así límites cuantitativos del rendimiento del ensayo. Utilizando B. pseudomallei como modelo, nuestro estudio proporciona un marco para la validación cuantitativa integral de ensayos moleculares y proporciona ensayos adicionales de B. pseudomallei altamente validados para la comunidad de investigación científica.

Files

journal.pone.0037723&type=printable.pdf

Files (416.8 kB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:01f1acaed10b82b2b4e2db1f37e10ad7
416.8 kB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تطوير والتحقق من فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الخاصة بالبوركهولدريا لتطبيقات الكشف السريري أو البيئي أو الجنائي
Translated title (French)
Développement et validation de tests PCR en temps réel spécifiques à Burkholderia pseudomallei pour des applications de détection clinique, environnementale ou médico-légale
Translated title (Spanish)
Desarrollo y validación de ensayos de PCR en tiempo real específicos de Burkholderia pseudomallei para aplicaciones de detección clínica, ambiental o forense

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2147963625
DOI
10.1371/journal.pone.0037723

Is supplement to
https://openalex.org/W4280545381 (Other)
https://openalex.org/W3025277965 (Other)
https://openalex.org/W2904196444 (Other)
https://openalex.org/W2475044402 (Other)
https://openalex.org/W2407415576 (Other)
https://openalex.org/W2126115162 (Other)
https://openalex.org/W2069649144 (Other)
https://openalex.org/W1984080932 (Other)
https://openalex.org/W1975021899 (Other)
https://openalex.org/W1898070688 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
Thailand

References

  • https://openalex.org/W1741143219
  • https://openalex.org/W1978237876
  • https://openalex.org/W1995816745
  • https://openalex.org/W1997527498
  • https://openalex.org/W2010682604
  • https://openalex.org/W2015241243
  • https://openalex.org/W2018718318
  • https://openalex.org/W2020874957
  • https://openalex.org/W2031012242
  • https://openalex.org/W2039246819
  • https://openalex.org/W2040309911
  • https://openalex.org/W2052003870
  • https://openalex.org/W2055043387
  • https://openalex.org/W2084231829
  • https://openalex.org/W2091819001
  • https://openalex.org/W2100410879
  • https://openalex.org/W2102332312
  • https://openalex.org/W2105753785
  • https://openalex.org/W2107233780
  • https://openalex.org/W2108030761
  • https://openalex.org/W2110977811
  • https://openalex.org/W2113581461
  • https://openalex.org/W2114828726
  • https://openalex.org/W2115779495
  • https://openalex.org/W2116042511
  • https://openalex.org/W2116832454
  • https://openalex.org/W2119404698
  • https://openalex.org/W2123403764
  • https://openalex.org/W2125512767
  • https://openalex.org/W2131150306
  • https://openalex.org/W2133435340
  • https://openalex.org/W2135485869
  • https://openalex.org/W2136314281
  • https://openalex.org/W2144363708
  • https://openalex.org/W2147626311
  • https://openalex.org/W2149615908
  • https://openalex.org/W2153390532
  • https://openalex.org/W2157584041
  • https://openalex.org/W2165955930
  • https://openalex.org/W2166491902
  • https://openalex.org/W2167060082
  • https://openalex.org/W2169175634
  • https://openalex.org/W2474809448