Published January 8, 2022 | Version v1
Publication Open

High-resolution melting analysis identifies reservoir hosts of zoonotic Leishmania parasites in Tunisia

Creators

  • 1. Institut Pasteur de Tunis
  • 2. Tunis El Manar University
  • 3. Tunis University

Description

Abstract Background Leishmaniasis is endemic in Tunisia and presents with different clinical forms, caused by the species Leishmania infantum , Leishmania major , and Leishmania tropica . The life cycle of Leishmania is complex and involves several phlebotomine sand fly vectors and mammalian reservoir hosts. The aim of this work is the development and evaluation of a high-resolution melting PCR (PCR-HRM) tool to detect and identify Leishmania parasites in wild and domestic hosts, constituting confirmed (dogs and Meriones rodents) or potential (hedgehogs) reservoirs in Tunisia. Methods Using in vitro-cultured Leishmania isolates, PCR-HRM reactions were developed targeting the 7SL RNA and HSP70 genes. Animals were captured or sampled in El Kef Governorate, North West Tunisia. DNA was extracted from the liver, spleen, kidney, and heart from hedgehogs ( Atelerix algirus ) ( n = 3) and rodents ( Meriones shawi ) ( n = 7) and from whole blood of dogs ( n = 12) that did not present any symptoms of canine leishmaniasis. In total, 52 DNA samples were processed by PCR-HRM using both pairs of primers. Results The results showed melting curves enabling discrimination of the three Leishmania species present in Tunisia, and were further confirmed by Sanger sequencing. Application of PCR-HRM assays on reservoir host samples showed that overall among the examined samples, 45 were positive, while seven were negative, with no Leishmania infection. Meriones shawi were found infected with L. major , while dogs were infected with L. infantum . However, co-infections with L. major / L. infantum species were detected in four Meriones specimens and in all tested hedgehogs. In addition, multiple infections with the three Leishmania species were found in one hedgehog specimen. Sequence analyses of PCR-HRM products corroborated the Leishmania species found in analyzed samples. Conclusions The results of PCR-HRM assays applied to field specimens further support the possibility of hedgehogs as reservoir hosts of Leishmania . In addition, we showed their usefulness in the diagnosis of canine leishmaniasis, specifically in asymptomatic dogs, which will ensure a better evaluation of infection extent, thus improving elaboration of control programs. This PCR-HRM method is a robust and reliable tool for molecular detection and identification of Leishmania and can be easily implemented in epidemiological surveys in endemic regions. Graphical Abstract

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

ملخص خلفية داء اللشمانيا متوطن في تونس ويظهر بأشكال سريرية مختلفة، تسببها أنواع اللشمانيا الطفولية واللشمانيا الكبرى واللشمانيا الاستوائية . دورة حياة الليشمانيا معقدة وتشمل العديد من ناقلات ذبابة الرمل الفليبوتومينية ومضيفات مستودعات الثدييات. الهدف من هذا العمل هو تطوير وتقييم أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل عالية الدقة (PCR - HRM) للكشف عن طفيليات الليشمانيا وتحديدها في المضيفات البرية والمحلية، والتي تشكل خزانات مؤكدة (الكلاب والقوارض المريونية) أو خزانات محتملة (القنافذ) في تونس. باستخدام عزلات الليشمانيا المزروعة في المختبر، تم تطوير تفاعلات PCR - HRM التي تستهدف جينات الحمض النووي الريبي 7SL و Hsp70. تم القبض على الحيوانات أو أخذ عينات منها في محافظة الكاف، شمال غرب تونس. تم استخراج الحمض النووي من الكبد والطحال والكلى والقلب من القنافذ ( Atelerix algirus ) ( العدد = 3) والقوارض ( Meriones shawi) ( العدد = 7) ومن الدم الكامل للكلاب ( العدد = 12) التي لم تقدم أي أعراض لداء الليشمانيات الكلبي. في المجموع، تمت معالجة 52 عينة من الحمض النووي بواسطة PCR - HRM باستخدام كلا الزوجين من البرايمر. النتائج أظهرت النتائج منحنيات ذوبان تمكن من التمييز بين أنواع الليشمانيا الثلاثة الموجودة في تونس، وتم تأكيدها بشكل أكبر من خلال تسلسل سانجر. أظهر تطبيق فحوصات PCR - HRM على عينات مضيف الخزان أنه بشكل عام من بين العينات التي تم فحصها، كانت 45 إيجابية، بينما كانت سبعة سلبية، مع عدم وجود عدوى الليشمانيا. تم العثور على ميريونس شاوي مصابة بـ L. major ، بينما أصيبت الكلاب بـ L. infantum . ومع ذلك، تم الكشف عن العدوى المشتركة مع L. الرئيسية / L. أنواع الرضع في أربع عينات من المريونس وفي جميع القنافذ التي تم اختبارها. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على عدوى متعددة بأنواع الليشمانيا الثلاثة في عينة واحدة من القنفذ. أكدت تحليلات تسلسل منتجات PCR - HRM أنواع الليشمانيا الموجودة في العينات التي تم تحليلها. الاستنتاجات تدعم نتائج فحوصات PCR - HRM المطبقة على العينات الميدانية إمكانية القنافذ كمضيفين لخزان الليشمانيا . بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا فائدتها في تشخيص داء الليشمانيات الكلبي، وتحديدًا في الكلاب عديمة الأعراض، مما سيضمن تقييمًا أفضل لمدى العدوى، وبالتالي تحسين وضع برامج المكافحة. تعد طريقة PCR - HRM هذه أداة قوية وموثوقة للكشف الجزيئي عن الليشمانيا وتحديدها ويمكن تنفيذها بسهولة في المسوحات الوبائية في المناطق الموبوءة. الملخص البياني

Translated Description (French)

Résumé Contexte La leishmaniose est endémique en Tunisie et présente différentes formes cliniques, causées par les espèces Leishmania infantum , Leishmania major et Leishmania tropica . Le cycle de vie de Leishmania est complexe et implique plusieurs vecteurs phlébotomines de phlébotomie et des hôtes réservoirs mammifères. L'objectif de ce travail est le développement et l'évaluation d'un outil de PCR de fusion à haute résolution (PCR-HRM) pour détecter et identifier les parasites Leishmania chez les hôtes sauvages et domestiques, constituant des réservoirs confirmés (chiens et rongeurs Meriones) ou potentiels (hérissons) en Tunisie. Méthodes À l'aide d'isolats de Leishmania cultivés in vitro, des réactions PCR-HRM ont été développées ciblant les gènes 7SL RNA et HSP70. Des animaux ont été capturés ou échantillonnés dans le gouvernorat d'El Kef, dans le nord-ouest de la Tunisie. L'ADN a été extrait du foie, de la rate, des reins et du cœur de hérissons ( Atelerix algirus ) ( n = 3) et de rongeurs ( Meriones shawi ) ( n = 7) et de sang total de chiens ( n = 12) qui ne présentaient aucun symptôme de leishmaniose canine. Au total, 52 échantillons d'ADN ont été traités par PCR-HRM en utilisant les deux paires d'amorces. Résultats Les résultats ont montré des courbes de fusion permettant la discrimination des trois espèces de Leishmania présentes en Tunisie, et ont été confirmés par le séquençage de Sanger. L'application de tests PCR-HRM sur des échantillons d'hôtes réservoirs a montré que, globalement, parmi les échantillons examinés, 45 étaient positifs, tandis que sept étaient négatifs, sans infection par Leishmania. Des Meriones shawi ont été trouvés infectés par L. major , tandis que des chiens ont été infectés par L. infantum . Cependant, des co-infections avec des espèces de L. major / L. infantum ont été détectées chez quatre spécimens de Meriones et chez tous les hérissons testés. De plus, de multiples infections par les trois espèces de Leishmania ont été trouvées dans un spécimen de hérisson. Les analyses de séquence des produits PCR-HRM ont corroboré les espèces de Leishmania trouvées dans les échantillons analysés. Conclusions Les résultats des tests PCR-HRM appliqués à des échantillons de terrain soutiennent davantage la possibilité que les hérissons soient des hôtes réservoirs de Leishmania . De plus, nous avons montré leur utilité dans le diagnostic de la leishmaniose canine, en particulier chez les chiens asymptomatiques, ce qui assurera une meilleure évaluation de l'étendue de l'infection, améliorant ainsi l'élaboration des programmes de contrôle. Cette méthode PCR-HRM est un outil robuste et fiable pour la détection moléculaire et l'identification de Leishmania et peut être facilement mise en œuvre dans les enquêtes épidémiologiques dans les régions endémiques. Résumé graphique

Translated Description (Spanish)

Resumen Antecedentes La leishmaniasis es endémica en Túnez y se presenta con diferentes formas clínicas, causadas por las especies Leishmania infantum , Leishmania major y Leishmania tropica . El ciclo de vida de Leishmania es complejo e involucra a varios vectores flebotominos de la mosca de la arena y reservorios de mamíferos. El objetivo de este trabajo es el desarrollo y evaluación de una herramienta de PCR de fusión de alta resolución (PCR-HRM) para detectar e identificar parásitos de Leishmania en huéspedes silvestres y domésticos, que constituyen reservorios confirmados (perros y roedores Meriones) o potenciales (erizos) en Túnez. Métodos Utilizando aislados de Leishmania cultivados in vitro, se desarrollaron reacciones PCR-HRM dirigidas a los genes 7SL ARN y HSP70. Los animales fueron capturados o muestreados en la gobernación de El Kef, en el noroeste de Túnez. Se extrajo ADN del hígado, bazo, riñón y corazón de erizos ( Atelerix algirus ) ( n = 3) y roedores ( Meriones shawi ) ( n = 7) y de sangre entera de perros ( n = 12) que no presentaban ningún síntoma de leishmaniasis canina. En total, se procesaron 52 muestras de ADN mediante PCR-HRM utilizando ambos pares de cebadores. Resultados Los resultados mostraron curvas de fusión que permitieron la discriminación de las tres especies de Leishmania presentes en Túnez, y se confirmaron aún más mediante la secuenciación de Sanger. La aplicación de ensayos PCR-HRM en muestras del huésped reservorio mostró que, en general, entre las muestras examinadas, 45 fueron positivas, mientras que siete fueron negativas, sin infección por Leishmania. Se encontró que Meriones shawi estaba infectada con L. major , mientras que los perros estaban infectados con L. infantum . Sin embargo, se detectaron coinfecciones con especies de L. major / L. infantum en cuatro especímenes de Meriones y en todos los erizos probados. Además, se encontraron múltiples infecciones con las tres especies de Leishmania en un espécimen de erizo. Los análisis de secuencia de los productos PCR-HRM corroboraron las especies de Leishmania encontradas en las muestras analizadas. Conclusiones Los resultados de los ensayos PCR-HRM aplicados a especímenes de campo respaldan aún más la posibilidad de que los erizos sean huéspedes reservorio de Leishmania . Además, mostramos su utilidad en el diagnóstico de la leishmaniasis canina, específicamente en perros asintomáticos, lo que asegurará una mejor evaluación de la extensión de la infección, mejorando así la elaboración de programas de control. Este método PCR-HRM es una herramienta robusta y confiable para la detección e identificación molecular de Leishmania y se puede implementar fácilmente en encuestas epidemiológicas en regiones endémicas.

Files

s13071-021-05138-x.pdf

Files (4.2 MB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:ca0b1ec1d5c20f60186684f5ba9c417e
4.2 MB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تحليل ذوبان عالي الدقة يحدد مستودعات طفيليات الليشمانيا حيوانية المنشأ في تونس
Translated title (French)
L'analyse de fusion à haute résolution identifie les hôtes réservoirs de parasites zoonotiques de Leishmania en Tunisie
Translated title (Spanish)
El análisis de fusión de alta resolución identifica reservorios de parásitos zoonóticos de Leishmania en Túnez

Identifiers

Other
https://openalex.org/W4205542683
DOI
10.1186/s13071-021-05138-x

Is supplement to
https://openalex.org/W3167139817 (Other)
https://openalex.org/W2772501664 (Other)
https://openalex.org/W2886385847 (Other)
https://openalex.org/W2903001743 (Other)
https://openalex.org/W2427615828 (Other)
https://openalex.org/W2541039703 (Other)
https://openalex.org/W2063931411 (Other)
https://openalex.org/W2115957392 (Other)
https://openalex.org/W324504601 (Other)
https://openalex.org/W3134185700 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
Tunisia

References

  • https://openalex.org/W9307905
  • https://openalex.org/W614720040
  • https://openalex.org/W1642368452
  • https://openalex.org/W1672786836
  • https://openalex.org/W1957934977
  • https://openalex.org/W1964326400
  • https://openalex.org/W1965703855
  • https://openalex.org/W1967477545
  • https://openalex.org/W1974744439
  • https://openalex.org/W1983916351
  • https://openalex.org/W1993214105
  • https://openalex.org/W1999472064
  • https://openalex.org/W2030177678
  • https://openalex.org/W2042643101
  • https://openalex.org/W2045873956
  • https://openalex.org/W2050995804
  • https://openalex.org/W2051021300
  • https://openalex.org/W2060747484
  • https://openalex.org/W2073998162
  • https://openalex.org/W2091234729
  • https://openalex.org/W2105881539
  • https://openalex.org/W2119058421
  • https://openalex.org/W2128765957
  • https://openalex.org/W2128835407
  • https://openalex.org/W2131902485
  • https://openalex.org/W2133894706
  • https://openalex.org/W2143370067
  • https://openalex.org/W2146053290
  • https://openalex.org/W2159769705
  • https://openalex.org/W2163866783
  • https://openalex.org/W2192417191
  • https://openalex.org/W2289712869
  • https://openalex.org/W2296520086
  • https://openalex.org/W2311052219
  • https://openalex.org/W2559180767
  • https://openalex.org/W2605151709
  • https://openalex.org/W2613892757
  • https://openalex.org/W2760914700
  • https://openalex.org/W2761741692
  • https://openalex.org/W2765200941
  • https://openalex.org/W2766685560
  • https://openalex.org/W2784076996
  • https://openalex.org/W2806814588
  • https://openalex.org/W2884800309
  • https://openalex.org/W2891992621
  • https://openalex.org/W2910068933
  • https://openalex.org/W2914674866
  • https://openalex.org/W2938363595
  • https://openalex.org/W2942281207
  • https://openalex.org/W2942333799
  • https://openalex.org/W2943171564
  • https://openalex.org/W2955126047
  • https://openalex.org/W2967500952
  • https://openalex.org/W2976262049
  • https://openalex.org/W2979491305
  • https://openalex.org/W2981168654
  • https://openalex.org/W2982448645
  • https://openalex.org/W2983584532
  • https://openalex.org/W2987086398
  • https://openalex.org/W2997876791
  • https://openalex.org/W3000696462
  • https://openalex.org/W3008545494
  • https://openalex.org/W3010768989
  • https://openalex.org/W3105450407
  • https://openalex.org/W4233424756