Published February 18, 2013
| Version v1
Publication
Open
Expression of a secretory α-glucosidase II from Apis cerana indica in Pichia pastoris and its characterization
Creators
- 1. Chulalongkorn University
- 2. National Science and Technology Development Agency
- 3. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology
- 4. Institute of Livestock and Grassland Science
- 5. Hokkaido University
Description
α-glucosidase (HBGase) plays a key role in hydrolyzing α-glucosidic linkages. In Apis mellifera, three isoforms of HBGase (I, II and III) have been reported, which differ in their nucleotide composition, encoding amino acid sequences and enzyme kinetics. Recombinant (r)HBGase II from A. cerana indica (rAciHBGase II) was focused upon here due to the fact it is a native and economic honeybee species in Thailand. The data is compared to the two other isoforms, AciHBGase I and III from the same bee species and to the three isoforms (HBGase I, II and III) in different bee species where available.The highest transcript expression level of AciHBGase II was found in larvae and pupae, with lower levels in the eggs of A. cerana indica but it was not found in foragers. The full-length AciHBGase II cDNA, and the predicted amino acid sequence it encodes were 1,740 bp and 579 residues, respectively. The cDNA sequence was 90% identical to that from the HBGase II from the closely related A. cerana japonica (GenBank accession # NM_FJ752630.1). The full length cDNA was directionally cloned into the pPICZαA expression vector in frame with a (His)(6) encoding C terminal tag using EcoRI and KpnI compatible ends, and transformed into Pichia pastoris. Maximal expression of the rAciHBGase II-(His)(6) protein was induced by 0.5% (v/v) methanol for 96 h and secreted into the culture media. The partially purified enzyme was found to have optimal α-glucosidase activity at pH 3.5 and 45°C, with > 80% activity between pH 3.5-5.0 and 40-55°C, and was stabile (> 80% activity) at pH 4-8 and at < 25-65°C. The optimal substrate was sucrose.Like in A. mellifera, there are three isoforms of AciHBGase (I, II and III) that differ in their transcript expression pattern, nucleotide sequences and optimal enzyme conditions and kinetics.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
يلعب α - glucosidase (HBGase) دورًا رئيسيًا في تحلل الروابط α - glucosidic. في Apis mellifera، تم الإبلاغ عن ثلاثة أشكال متساوية من HBGase (I و II و III)، والتي تختلف في تكوين النيوكليوتيدات، وترميز تسلسلات الأحماض الأمينية وحركية الإنزيم. تم التركيز على HBGase II المؤتلف من A. cerana indica (rAciHBGase II) هنا نظرًا لحقيقة أنه نوع أصلي واقتصادي من نحل العسل في تايلاند. تتم مقارنة البيانات مع اثنين من الأشكال المتماثلة الأخرى، AciHBGase I و III من نفس أنواع النحل ومع الأشكال المتماثلة الثلاثة (HBGase I و II و III) في أنواع النحل المختلفة حيثما كان ذلك متاحًا. تم العثور على أعلى مستوى للتعبير النصي لـ AciHBGase II في اليرقات والشرانق، مع مستويات أقل في بيض A. cerana indica ولكن لم يتم العثور عليه في العلف. كان AciHBGase II cDNA كامل الطول، وتسلسل الأحماض الأمينية المتوقع الذي يشفره هو 1,740 نقطة أساس و 579 بقايا، على التوالي. كان تسلسل cDNA مطابقًا بنسبة 90 ٪ لتسلسل HBGase II من A. cerana japonica ذات الصلة الوثيقة (انضمام بنك الجينات # NM_FJ752630.1). تم استنساخ cDNA كامل الطول اتجاهيًا في متجه تعبير pPICZαA في إطار مع علامة طرفية C مشفرة (HIS)(6) باستخدام نهايات متوافقة مع EcoRI و KpnI، وتحولت إلى Pichia pastoris. تم تحفيز التعبير الأقصى للبروتين rAciHBGase II -(His)(6) بنسبة 0.5 ٪ (v/v) من الميثانول لمدة 96 ساعة وتم إفرازه في وسائط الاستزراع. وجد أن الإنزيم المنقى جزئيًا له نشاط α - glucosidase الأمثل عند درجة الحموضة 3.5 و 45 درجة مئوية، مع نشاط > 80 ٪ بين درجة الحموضة 3.5-5.0 و 40-55 درجة مئوية، وكان ثابتًا (> 80 ٪ نشاط) عند درجة الحموضة 4-8 وعند < 25-65 درجة مئوية. كانت الركيزة المثلى هي السكروز. كما هو الحال في A. mellifera، هناك ثلاثة أشكال متساوية من AciHBGase (I و II و III) تختلف في نمط التعبير عن النسخ وتسلسل النوكليوتيدات وظروف الإنزيم الأمثل والحركية.Translated Description (French)
l'α-glucosidase (HBGase) joue un rôle clé dans l'hydrolyse des liaisons α-glucosidiques. Dans Apis mellifera, trois isoformes de l'HBGase (I, II et III) ont été rapportées, qui diffèrent par leur composition nucléotidique, leur codage des séquences d'acides aminés et leur cinétique enzymatique. La (r) HBGaseII recombinante de A. cerana indica (rAciHBGase II) a été ciblée ici en raison du fait qu'il s'agit d'une espèce d'abeille domestique indigène et économique en Thaïlande. Les données sont comparées aux deux autres isoformes, AciHBGase I et III de la même espèce d'abeille et aux trois isoformes (HBGase I, II et III) chez différentes espèces d'abeilles, le cas échéant. Le niveau d'expression de transcription le plus élevé d'AciHBGase II a été trouvé chez les larves et les pupes, avec des niveaux plus faibles dans les œufs d'A. cerana indica, mais il n'a pas été trouvé chez les butineuses. L'ADNc complet de l'AciHBGase II et la séquence d'acides aminés prédite qu'il code étaient de 1 740 pb et 579 résidus, respectivement. La séquence d'ADNc était identique à 90 % à celle de la HBGase II de l'A. cerana japonica étroitement apparentée (GenBank accession # NM_FJ752630.1). L'ADNc pleine longueur a été cloné de manière directionnelle dans le vecteur d'expression pPICZαA en trame avec une étiquette de codage (His)(6) du terminal C à l'aide d'extrémités compatibles EcoRI et KpnI, et transformé en Pichia pastoris. L'expression maximale de la protéine rAciHBGase II-(His)(6) a été induite par 0,5% (v/v) de méthanol pendant 96 h et sécrétée dans les milieux de culture. L'enzyme partiellement purifiée s'est avérée avoir une activité α-glucosidase optimale à pH 3,5 et 45 °C, avec une activité > 80 % entre pH 3,5-5,0 et 40-55 °C, et était stable (activité > 80 %) à pH 4-8 et à < 25-65 °C. Le substrat optimal était le saccharose. Comme chez A. mellifera, il existe trois isoformes de l'AciHBGase (I, II et III) qui diffèrent par leur modèle d'expression du transcrit, leurs séquences nucléotidiques et leurs conditions et cinétiques enzymatiques optimales.Translated Description (Spanish)
la α-glucosidasa (HBGasa) desempeña un papel clave en la hidrólisis de los enlaces α-glucosídicos. En Apis mellifera, se han reportado tres isoformas de HBGasa (I, II y III), que difieren en su composición de nucleótidos, codificando secuencias de aminoácidos y cinética enzimática. La (r)HBGasa II recombinante de A. cerana indica (rAciHBGasa II) se centró aquí debido al hecho de que es una especie de abeja nativa y económica en Tailandia. Los datos se comparan con las otras dos isoformas, AciHBGasa I y III de la misma especie de abeja y con las tres isoformas (HBGasa I, II y III) en diferentes especies de abejas cuando están disponibles. El nivel de expresión de transcripción más alto de AciHBGasa II se encontró en larvas y pupas, con niveles más bajos en los huevos de A. cerana indica pero no se encontró en forrajeros. El ADNc de AciHBGasa II de longitud completa y la secuencia de aminoácidos predicha que codifica fueron de 1.740 pb y 579 residuos, respectivamente. La secuencia de ADNc fue 90% idéntica a la de la HBGasa II de A. cerana japonica estrechamente relacionada (n .º de acceso de GenBank NM_FJ752630.1). El ADNc de longitud completa se clonó direccionalmente en el vector de expresión pPICZαA en marco con una etiqueta C terminal que codifica (His)(6) utilizando extremos compatibles con EcoRI y KpnI, y se transformó en Pichia pastoris. La expresión máxima de la proteína rAciHBGasa II-(His)(6) se indujo con metanol al 0,5% (v/v) durante 96 h y se secretó en el medio de cultivo. Se encontró que la enzima parcialmente purificada tenía una actividad α-glucosidasa óptima a pH 3,5 y 45 °C, con > 80% de actividad entre pH 3,5-5,0 y 40-55 °C, y era estable (> 80% de actividad) a pH 4-8 y a < 25-65 °C. El sustrato óptimo fue la sacarosa. Al igual que en A. mellifera, hay tres isoformas de AciHBGasa (I, II y III) que difieren en su patrón de expresión de transcripción, secuencias de nucleótidos y condiciones y cinéticas enzimáticas óptimas.Files
1472-6750-13-16.pdf
Files
(1.3 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:35978aba0852d0dad4cc99349755a8c2
|
1.3 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- التعبير عن إفراز α - glucosidase II من Apis cerana indica في Pichia pastoris وتوصيفه
- Translated title (French)
- Expression d'une α-glucosidase II sécrétoire de l'Apis cerana indica chez Pichia pastoris et sa caractérisation
- Translated title (Spanish)
- Expresión de una α-glucosidasa II secretora de Apis cerana indica en Pichia pastoris y su caracterización
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2151944205
- DOI
- 10.1186/1472-6750-13-16
References
- https://openalex.org/W1831583243
- https://openalex.org/W1958924188
- https://openalex.org/W1977495823
- https://openalex.org/W1978681253
- https://openalex.org/W1979966636
- https://openalex.org/W1993924598
- https://openalex.org/W1996915903
- https://openalex.org/W1996926354
- https://openalex.org/W2002989562
- https://openalex.org/W2014834146
- https://openalex.org/W2034190125
- https://openalex.org/W2047994751
- https://openalex.org/W2050723215
- https://openalex.org/W2051544456
- https://openalex.org/W2053091933
- https://openalex.org/W2054979333
- https://openalex.org/W2056478864
- https://openalex.org/W2058484488
- https://openalex.org/W2060645310
- https://openalex.org/W2068738247
- https://openalex.org/W2069977927
- https://openalex.org/W2078819867
- https://openalex.org/W2083063733
- https://openalex.org/W2083354414
- https://openalex.org/W2095022921
- https://openalex.org/W2097233732
- https://openalex.org/W2113964973
- https://openalex.org/W2119019886
- https://openalex.org/W2154314250
- https://openalex.org/W2163435252
- https://openalex.org/W2339137509
- https://openalex.org/W2470018892
- https://openalex.org/W4253565803
- https://openalex.org/W4293247451