Published May 1, 2003 | Version v1
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Relaxed Sugar Donor Selectivity of a Sinorhizobium meliloti Ortholog of the Rhizobium leguminosarumMannosyl Transferase LpcC

Creators

  • 1. Duke University Hospital
  • 2. Duke Medical Center
  • 3. Johns Hopkins Medicine
  • 4. Johns Hopkins University
  • 5. Universidad Nacional de La Plata
  • 6. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular

Description

The lpcC gene of Rhizobium leguminosarum and the lpsB gene ofSinorhizobium meliloti encode protein orthologs that are 58% identical over their entire lengths of about 350 amino acid residues. LpcC and LpsB are required for symbiosis with pea andMedicago plants, respectively. S. meliloti lpsBcomplements a mutant of R. leguminosarum defective inlpcC, but the converse does not occur. LpcC encodes a highly selective mannosyl transferase that utilizes GDP-mannose to glycosylate the inner 3-deoxy-d-manno-octulosonic acid (Kdo) residue of the lipopolysaccharide precursor Kdo2-lipid IVA. We now demonstrate that LpsB can also efficiently mannosylate the same acceptor substrate as does LpcC. Unexpectedly, however, the sugar nucleotide selectivity of LpsB is greatly relaxed compared with that of LpcC. Membranes of the wild-type S. meliloti strain 2011 catalyze the glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA at comparable rates using a diverse set of sugar nucleotides, including GDP-mannose, ADP-mannose, UDP-glucose, and ADP-glucose. This complex pattern of glycosylation is due entirely to LpsB, since membranes of the S. meliloti lpsB mutant 6963 do not glycosylate Kdo2-[4′-32P]lipid IVA in the presence of any of these sugar nucleotides. Expression oflpsB in E. coli using a T7lacpromoter-driven construct results in the appearance of similar multiple glycosyl transferase activities seen in S. meliloti 2011 membranes. Constructs expressing lpcC display only mannosyl transferase activity. We conclude that LpsB, despite its high degree of similarity to LpcC, is a much more versatile glycosyltransferase, probably accounting for the inability of lpcC to complementS. meliloti lpsB mutants. Our findings have important implications for the regulation of core glycosylation in S. meliloti and other bacteria containing LpcC orthologs. The lpcC gene of Rhizobium leguminosarum and the lpsB gene ofSinorhizobium meliloti encode protein orthologs that are 58% identical over their entire lengths of about 350 amino acid residues. LpcC and LpsB are required for symbiosis with pea andMedicago plants, respectively. S. meliloti lpsBcomplements a mutant of R. leguminosarum defective inlpcC, but the converse does not occur. LpcC encodes a highly selective mannosyl transferase that utilizes GDP-mannose to glycosylate the inner 3-deoxy-d-manno-octulosonic acid (Kdo) residue of the lipopolysaccharide precursor Kdo2-lipid IVA. We now demonstrate that LpsB can also efficiently mannosylate the same acceptor substrate as does LpcC. Unexpectedly, however, the sugar nucleotide selectivity of LpsB is greatly relaxed compared with that of LpcC. Membranes of the wild-type S. meliloti strain 2011 catalyze the glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA at comparable rates using a diverse set of sugar nucleotides, including GDP-mannose, ADP-mannose, UDP-glucose, and ADP-glucose. This complex pattern of glycosylation is due entirely to LpsB, since membranes of the S. meliloti lpsB mutant 6963 do not glycosylate Kdo2-[4′-32P]lipid IVA in the presence of any of these sugar nucleotides. Expression oflpsB in E. coli using a T7lacpromoter-driven construct results in the appearance of similar multiple glycosyl transferase activities seen in S. meliloti 2011 membranes. Constructs expressing lpcC display only mannosyl transferase activity. We conclude that LpsB, despite its high degree of similarity to LpcC, is a much more versatile glycosyltransferase, probably accounting for the inability of lpcC to complementS. meliloti lpsB mutants. Our findings have important implications for the regulation of core glycosylation in S. meliloti and other bacteria containing LpcC orthologs. lipopolysaccharide 3-deoxy-d-manno-octulosonic acid matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight As shown in the preceding paper (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar), LpcC of Rhizobium leguminosarum is a highly selective mannosyl transferase that utilizes the sugar nucleotide GDP-mannose for the enzymatic glycosylation of the acceptor Kdo2-lipid IVA. These findings are consistent with earlier structural studies by Carlson and co-workers (2Bhat U.R. Krishnaiah B.S. Carlson R.W. Carbohydr. Res. 1991; 220: 219-227Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 3Carlson R.W. Reuhs B. Chen T.B. Bhat U.R. Noel K.D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 11783-11788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar) demonstrating that mannose is the sole sugar attached to the inner Kdo moiety of the core oligosaccharide ofR. leguminosarum or Rhizobium etlilipopolysaccharide (LPS)1(see Fig. 1 of the preceding paper). Furthermore, mutants of R. leguminosarum lacking lpcC are deficient in mannosyl transferase activity, are unable to form functional root nodules onPisum sativum, and synthesize a truncated LPS molecule lacking the usual core sugar residues beyond the Kdo disaccharide (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). Detailed structural studies of the LPS core of Sinorhizobium meliloti have not yet been reported. 2R. Carlson, personal communication. The S. meliloti core is complex, and it may contain glucose and galactose residues (5Campbell G.R. Reuhs B.L. Walker G.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 3938-3943Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar).2 The recent sequencing of the S. meliloti genome (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy-Hubler F. Barnett M.J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez-Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R.W. Jones T. Kahn D. Kahn M.L. Kalman S. Keating D.H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. Palm C. Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. Thebault P. Vandenbol M. Vorholter F.J. Weidner S. Wells D.H. Wong K. Yeh K.C. Batut J. Science. 2001; 293: 668-672Crossref PubMed Scopus (951) Google Scholar) and independent genetic studies by Lagareset al. (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) have demonstrated that a gene encoding an ortholog of LpcC is present in S. meliloti. Mutant 6963, which harbors a Tn5 insertion in this gene (designatedlpsB), is defective in symbiosis with Medicagospp. (8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google Scholar, 9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Initially, mutant 6963 derived from strain 2011 was shown to be delayed in nodulation and poorly competitive for nodule occupancy on alfalfa (Medicago sativa) (8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google Scholar). In later studies, the same mutant was found to be unable to fix nitrogen (Fix−) onMedicago truncatula (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Clear signs of plant defense were also observed with an abnormal pattern of infection as judged by electron microscopy (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). More recently, independent lpsBmutants generated with the related strain S. meliloti 1021 were reported to be Fix− in alfalfa. However, since 2011 and 1021 are both streptomycin-resistant derivatives of the wild type strain SU47, it may be that the defective nitrogen fixation phenotype seen in alfalfa with the lpsB mutant of strain 1021 is the consequence of both the lpsB lesion and some other as yet unidentified mutation in 1021 that is absent in strain 2011. Whatever the explanation, it is apparent that mutants defective inlpsB provide an interesting model system with which to probe the participation of LPS in symbiosis. As shown in Fig. 1, S. meliloti LpsB is 351 amino acid residues long and displays 58% identity and 72% similarity to LpcC over the full length of the entire protein. Accordingly, LpsB, like R. leguminosarum LpcC, would be expected to function as a mannosyl transferase. ThelpsB gene is, in fact, able to complement the truncation of lipopolysaccharide assembly and the nodulation deficiency seen in strain RSKnH, an lpcC mutant of R. leguminosarum(7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). However, lpcC is not able to restore normal lipopolysaccharide assembly to the S. meliloti lpsB mutant 6963 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). To understand the biochemical basis for this genetic anomaly, we have now characterized the glycosyl transferase activity of the parental strain S. meliloti 2011 and its LPS core biosynthesis/nodulation-deficient mutant 6963. We have also cloned thelpsB gene behind the T7lac promoter and expressed it in Escherichia coli. The results show conclusively that LpsB, like LpcC, can function as an effective mannosyl transferase using GDP-mannose as the donor and Kdo2-[4′-32P]lipid IVA as the acceptor substrate. However, unlike LpcC, LpsB shows comparable activity with several other sugar nucleotides, including ADP-glucose and UDP-glucose. These additional activities of LpsB may account for the observation that lpcC cannot substitute forlpsB in cells of S. meliloti (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Our findings further suggest that the most important functions of LpsB for S. meliloti biology are those related to the utilization of the sugar nucleotides other than GDP-mannose. How the LpsB protein acquires its relaxed sugar nucleotide selectivity when compared with LpcC can now be studied at the level of enzymology and structure. Sugar nucleotides, Kdo, and HEPES were obtained from Sigma. Bicinchoninic assay reagents and Triton X-100 were purchased from Pierce. Yeast extract and peptone-tryptone were from Difco. Silica Gel 60 thin layer chromatography plates were obtained from Merck. Reagent grade pyridine, chloroform, and methanol were purchased from VWR. [γ-32P]ATP was purchased from PerkinElmer Life Sciences. The bacterial strains and plasmids used in this study are listed in TableI. S. meliloti strains have been described previously (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). S. meliloti strains were grown in TY medium (10 g of NaCl, 10 g of peptone-tryptone, and 5 g of yeast extract per liter, supplemented with 10 mm calcium chloride) at 30 °C. When necessary, the cultures were also supplemented with streptomycin (400 μg/ml) and/or neoymcin (30 μg/ml). E. coli strain BLR(DE3)/pLysS (Novagen) was grown in LB broth (10Miller J.R. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1972Google Scholar) at 37 °C.Table ISinorhizobium meliloti strains and plasmids used in this studyBacterial strainsGenotypeLPS propertiesSource or referenceS. meliloti1021Parental wild typeFull-lengthRef.25Meade H.M. Long S.R. Ruvkun G.B. Brown S.E. Ausubel F.M. J. Bacteriol. 1982; 149: 114-122Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 2011Parental wild typeFull-lengthRef. 26Casse F. Boucher C. Julliot J.S. Michell M. Dénarié J. J. Gen. Microbiol. 1979; 113: 229-242Crossref Scopus (345) Google ScholarS. meliloti6963lpsB::Tn5Truncated inner coreRef. 8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 6963-BS. meliloti 6963 (pJBlpsSme)Full-lengthThis workS. meliloti6963-CS. meliloti 6963 (pPN120)Truncated as in 6963This workPlasmidsRelevant characteristicspJB3Tc19Derivative of the minimal replicon of plasmid RK2, Apr, TcrRef. 27Blatny J.M. Brautaset T. Winther-Larsen H.C. Haugan K. Valla S. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63: 370-379Crossref PubMed Google ScholarpAL100pACYC184-Gm-mob carrying in Dral a 5.5-kb SstI DNA fragment from S. meliloti 2011 harboring lpsBRef. 8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google ScholarpJB1psSmepJB3Tc19 carrying a 4.9-kb SstI-HindIII fragment with the regiongreA-lpsB-lpsE-lpsD from S. meliloti 2011 cloned into the polylinker of the vector betweenEcoRI-HindIII, KmrRef. 7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google ScholarpPN120pLAFR-1 with a 4.4 kb EcoRI fragment containinggreA, lpcC, dctA, and the 5′ region of dctB fromR. leguminosarum bv. viciae, TcrRefs. 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar and7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar Open table in a new tab Plasmids were prepared using the Qiagen Mini Prep Kit (Qiagen). Restriction endonucleases,Pfu polymerase (Stratagene), shrimp alkaline phosphatase, and T4 ligase (Invitrogen) were used according to the manufacturers' instructions. Competent cells of E. coliwere prepared for transformation using the calcium chloride method (11Bergmans H.E. van Die I.M. Hoekstra W.P. J. Bacteriol. 1981; 146: 564-570Crossref PubMed Google Scholar,12Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). Introduction of plasmids into S. meliloti was carried out by conjugation as previously described (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). PCR primers were designed to retrieve the S. meliloti lpsB gene from plasmid pAL100 (Table I) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) and to introduce NdeI and BamHI restriction sites at the ends of the PCR product, as indicated. The primers used to obtainlpsB have the following sequences: forward, 5′-GAATTCCATATGGTCGATATCCGCGACGTC-3′; reverse, 5′-GAATTCGGATCCTCAACGCATCAGGCTTTCGTAAAC-3′. The conditions for the PCR were as follows: 45 s of denaturation at 98 °C and then 25 cycles of denaturation (45 s, 98 °C), annealing (45 s, 55 °C), and extension (1.5 min, 72 °C). After the last cycle, an additional 10-min extension at 72 °C was performed. The resulting 1056-base pair DNA product was digested with the NdeI andBamHI restriction enzymes and ligated into an expression vector, pET28b, that had been digested with the same enzymes. The resulting ligation mixture was used to transform E. coli XL1 Blue, selecting for kanamycin resistance (30 μg/ml). The presence of the proper inserts in plasmids from several colonies was verified by restriction mapping. The desired construct, designated pMKRM, was then transferred into E. coli BLR(DE3)/pLysS for high level heterologous expression of lpsB. EachS. meliloti strain shown in Table I was grown from a single colony in 1 liter of TY medium containing the appropriate antibiotics to an optical density of 600 = 1.4 (late log phase). E. coli BLR(DE3)/pLysS/pMKRM was grown from a single colony in 1 liter of LB medium containing 30 μg/ml chloramphenicol and 30 μg/ml kanamycin at 37 °C until the A 600 reached ∼0.5. The culture was induced with 1 mmisopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside and incubated with shaking for an additional 3 h at 30 °C. Cells from the above 1-liter cultures were harvested at 4 °C by centrifugation at 4,000 × g for 10 min, were each resuspended in 30 ml of 50 mm HEPES, pH 7.5, and were broken by one passage through a French pressure cell at 18,000 p.s.i. Debris and inclusion bodies were removed by centrifugation at 4,000 × g for 15 min. Membranes were prepared by ultracentrifugation at 100,000 × g for 60 min. The membranes were resuspended in 20 ml of the same buffer, and the centrifugation was repeated a second time at 100,000 ×g to remove any remaining cytosol. Protein concentration was determined by the bicinchoninic method (13Smith P.K. Krohn R.I. Hermanson G.T. Mallia A.K. Gartner F.H. Provenzano M.D. Fujimoto E.K. Goeke N.M. Olson B.J. Klenk D.C. Anal. Biochem. 1985; 150: 76-85Crossref PubMed Scopus (19132) Google Scholar) (Pierce). The membrane pellet was resuspended at 10–15 mg of protein/ml in 50 mmHEPES, pH 7.5, and stored at −80 °C until further use. The mannosyl transferases LpcC and LpsB were assayed using the lipopolysaccharide precursor Kdo2-[4′-32P]lipid IVA, which was synthesized, isolated, and stored as a frozen aqueous dispersion, as described previously (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11139-11149Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar). Prior to each use, the radiolabeled substrate was subjected to ultrasonic irradiation in a water bath for 1 min. The mannosyl transferase was assayed as follows. The reaction mixture (10-μl final volume) contained 50 mm HEPES, pH 7.5, 0.1% Triton X-100, 1 mm GDP-mannose, and 10 μm Kdo2-[4′-32P]lipid IVA (3000–6000 cpm/nmol). The reaction was started by the addition of an appropriate amount of enzyme (usually at a final concentration of 1.0 mg/ml S. meliloti membranes or 0.02 mg/ml washed membranes of E. coli cells overexpressinglpsB behind the T7lac promoter) and incubated for the indicated times at 30 °C. The reactions were stopped by spotting 4-μl samples directly onto a silica gel thin layer plate. After drying the spots at room temperature, the plate was developed in the solvent chloroform, pyridine, 88% formic acid, water (30:70:16:10, v/v/v/v). Following removal of the solvent with a hot air stream, the plate was analyzed using an Amersham Biosciences PhosphorImager (Storm 840), equipped with ImageQuant software. Other glycosyl transferase activities of LpsB were assayed in the same way but in the presence of the indicated alternative sugar nucleotides present at 1 mm. LPS (i.e. Kdo2-lipid A) was extracted from a 100-ml culture of late log phase cells (OD = 1.4) with a single phase Bligh-Dyer mixture, consisting of chloroform/methanol/water (1:2:0.8, v/v/v). Following phase partitioning, the LPS was purified by chromatography on a DEAE-cellulose column, prepared in chloroform/methanol/water (2:3:1, v/v/v) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Spectra were acquired in the negative mode using a matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) Kompact 4 mass spectrometer (Kratos Analytical, Manchester, UK), equipped with a 337-nm nitrogen laser and set at a 20-kV extraction voltage. Conditions were the same as described in the preceding paper (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). As shown in Fig.2 A (lane 5), membranes of R. leguminosarum 3841 (15Poole P.S. Schofield N.A. Reid C.J. Drew E.M. Walshaw D.L. Microbiology. 1994; 140: 2797-2809Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar) glycosylate Kdo2-[4′-32P]lipid IVA in a highly selective manner using GDP-mannose as the preferred donor substrate. The nonphysiological analog ADP-mannose, a natural product found in corn (16Dankert M. Passeron S. Recondo E. Leloir L.F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1964; 14: 358-362Crossref PubMed Scopus (10) Google Scholar, 17Passeron S. Recondo E. Dankert M. Biochim. Biophys. Acta. 1964; 89: 372-374PubMed Google Scholar), can substitute for GDP-mannose (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32119-32125Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar), albeit not quite as effectively (Fig. 2 A,lane 4). Other core sugars cannot be incorporated prior to the addition of the first mannose residue to Kdo2-lipid IVA (data not shown) (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar, 19Brozek K.A. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32112-32118Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (41) Google Scholar). The mannosyl transferase activity of R. leguminosarumis catalyzed by LpcC, which displays very little transferase activity with other sugar nucleotide donors, such as ADP-glucose or UDP-glucose (Fig. 2 A, lanes 3 and 9, respectively) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar, 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). In earlier studies with S. meliloti 1021 (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32119-32125Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar), little or no mannosyl transferase activity was detected in cell extracts or membranes prepared from cells grown on TY medium. S. meliloti 1021 cells were therefore used for the expression cloning and characterization of lpcC from R. leguminosarum (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). However, when grown in a more controlled manner to late log phase, as described above, membranes of S. meliloti 1021 do in fact catalyze rapid mannosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA (Fig.2 B, lanes 12 and 13). Interestingly, other glycosylations of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA are observed with membranes of S. meliloti 1021 (Fig.2 B), which are absent in R. leguminosarum 3841 (Fig. 2 A), as judged by the shift of the radioactive substrate band to more slowly migrating species with ADP-glucose, UDP-galactose, and UDP-glucose (Fig. 2 B, lanes 11, 14, and 17, respectively). There is even the formation of some secondary glycosylation products of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA with ADP-glucose, UDP-galactose, and UDP-glucose (Fig. 2 B,lanes 11, 14, and 17), which are not seen when ADP-mannose or GDP-mannose are employed as the donor substrates (Fig. 2 B, lanes 12 and 13). Under matched conditions, ADP-glucose, UDP-galactose, and UDP-glucose do not support any glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA in membranes of R. leguminosarum 3841 (Fig.2 A) or R. etli CE3 (data not shown). NeitherR. leguminosarum nor S. meliloti 1021 membranes catalyze efficient glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA with UDP-GalUA or UDP-GlcNAc as sugar donors (Fig. 2, A(lanes 7 and 8) and B(lanes 15 and 16)). The formation of inorganic phosphate by membranes of R. leguminosarum is attributed to the 4′-phosphatase activity, which is absent in S. meliloti (Fig. 2, A versus B) (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11139-11149Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar, 20Price N.J.P. Jeyaretnam B. Carlson R.W. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. Brozek K.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 7352-7356Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar). The completed genome of S. meliloti 1021 (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy-Hubler F. Barnett M.J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez-Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R.W. Jones T. Kahn D. Kahn M.L. Kalman S. Keating D.H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. Palm C. Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. Thebault P. Vandenbol M. Vorholter F.J. Weidner S. Wells D.H. Wong K. Yeh K.C. Batut J. Science. 2001; 293: 668-672Crossref PubMed Scopus (951) Google Scholar) and intriguing recent studies of the isogenic S. meliloti 2011 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) have revealed the presence of a significant ortholog of LpcC (58% identity and 72% similarity over the full length of the protein) in both of these bacterial strains (Fig. 1). In the case of strain S. meliloti 2011, this LpcC ortholog (which was termed LpsB) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) is required both for core oligosaccharide assembly and for symbiosis withMedicago spp., as judged by the analysis of mutant 6963, which contains a Tn5 insertion in lpsB. We therefore decided to examine the glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA using membranes of S. meliloti 2011 and mutant 6963. When membranes of S. meliloti 2011 are assayed at 1 mg/ml for their ability to glycosylate Kdo2-[4′-32P]lipid IVA, essentially the same complex pattern of sugar additions is observed (Fig. 3) as with S. meliloti 1021 membranes (Fig. 2 B). When comparable washed membranes of S. meliloti mutant 6963 are assayed, no glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA of any kind is observed (data not shown). This striking result suggests that the diverse glycosylations seen in Figs.2 B and 3 are all the result of a single enzyme with relaxed sugar nucleotide substrate selectivity, when contrasted with LpcC. Based on this finding alone, however, some kind of pleiotropic regulatory effect secondary to the Tn5 insertion in the lpsBgene of mutant 6963 cannot be excluded. We have previously described the plasmids pJBlpsSme, which contains lpsB on a 4.9-kb fragment of S. meliloti 2011 DNA, and pPN120, which harbors lpcC on a 4.4-kb fragment of R. leguminosarum DNA (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). As shown in Fig.4, introduction of either of these plasmids into mutant 6963 (lanes 4 and5) restores full mannosyl transferase activity, as judged by assay of cell membranes with Kdo2-[4′-32P]lipid IVA in the presence of GDP-mannose. In fact, all of the other glycosylations of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA are also restored to mutant 6963 by plasmid pJBlpsSme (Fig.5). In contrast, when membranes from mutant 6963 cells harboring the lpcC containing plasmid pPN120 are assayed with the other sugar nucleotide donors (Fig.6), no activity is seen with ADP-glucose, UDP-galactose, or UDP-glucose, consistent with the substrate specificity of native R. leguminosarum membranes (Fig.2 A) and of purified LpcC (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). These results (Fig. 6) exclude the possibility that additional enzymes present in crude extracts ofS. meliloti 2011 are interconverting all of the various sugar nucleotides added to the assay system to account for the diverse glycosylations seen in Figs. 2 B, 3, and 5.Figure 5Restoration of other Kdo2-lipid IVA glycosylation reactions in membranes of lpsBmutant 6963 expressing S. meliloti lpsB. Reactions were carried out under standard conditions at pH 7.5 using a 1 mm concentration of each of the sugar nucleotides, as indicated. Membranes were used at 1 mg/ml. The incubation was carried out at 30 °C for 60 min.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Figure 6No Kdo2-lipid IVAglycosylation with sugars other than mannose in membranes oflpsB mutant 6963 expressing R. leguminosarum lpcC. Reactions were carried out under standard conditions at pH 7.5 using a 1 mm concentration of each of the sugar nucleotides, as indicated. Membranes were used as the enzyme source at 1 mg/ml. The incubation was carried out at 30 °C for 60 min.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) The lpsB gene of S. meliloti 2011 was cloned behind the T7lac promoter of the expression plasmid pET28b to generate pMKRM and transformed into the E. colistrain BLR(DE3)/pLysS. Washed membranes were then assayed from cells that had been induced in late log phase with isopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside for 3 h. As shown in Fig. 7 A(upper panel), membranes of cells harboring the vector control (at 0.02 mg/ml) catalyze little or no glycosylation of Kdo2-[4′-32P]lipid IVA, with

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Translated Description (Arabic)

يشفر جين lpcC من Rhizobium leguminosarum وجين lpsB من Sinorhizobium meliloti أورثولوجس البروتين التي تتطابق بنسبة 58 ٪ على أطوالها الكاملة من حوالي 350 بقايا الأحماض الأمينية. مطلوب LpcC و LpB للتعايش مع نباتات PEA و Medicago، على التوالي. S. meliloti lpsB يكمل طفرة من R. leguminosarum معيبة inlpc، ولكن العكس لا يحدث. يشفر LpcC ناقلة مانوسيل انتقائية للغاية تستخدم مانوز الناتج المحلي الإجمالي لجليكوسيلات حمض 3 - deoxy - d - manno - octulosonic الداخلي (Kdo) المتبقي من سلائف عديد السكاريد الشحمي Kdo2 - lipid IVA. نثبت الآن أن LpsB يمكنه أيضًا معالجة نفس ركيزة المستقبل بكفاءة كما يفعل LpcC. ومع ذلك، بشكل غير متوقع، فإن انتقائية نوكليوتيدات السكر في LpsB مسترخية إلى حد كبير مقارنة بانتقائية LpcC. تحفز أغشية سلالة S. meliloti من النوع البري 2011 الارتباط الغليكوزي لـ Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA بمعدلات مماثلة باستخدام مجموعة متنوعة من نيوكليوتيدات السكر، بما في ذلك الناتج المحلي الإجمالي مانوز، ADP - مانوز، UDP - glucose، و ADP - glucose. هذا النمط المعقد من الجليكوزيلات يرجع بالكامل إلى LpsB، لأن أغشية S. meliloti lpsB mutant 6963 لا تحتوي على جليكوسيلات Kdo2 - [4 ′-32 P]دهون IVA في وجود أي من نيوكليوتيدات السكر هذه. يؤدي التعبير عن lpsB في E. coli باستخدام بنية يحركها T7lacpromoter إلى ظهور أنشطة نقل جليكوزيل متعددة مماثلة شوهدت في أغشية S. meliloti 2011. يبني التعبير عن lpcc عرض نشاط مانوسيل ترانسفيراز فقط. نستنتج أن LpsB، على الرغم من درجة تشابهه العالية مع LpcC، هو ناقلة جليكوسيل أكثر تنوعًا، وربما يفسر عدم قدرة lpc على تكملة طفرات Meliloti lpsB. النتائج التي توصلنا إليها لها آثار مهمة على تنظيم الغليكوزيل الأساسي في S. meliloti والبكتيريا الأخرى التي تحتوي على LpcC orthologs. يشفر جين lpcC من Rhizobium leguminosarum وجين lpsB من Sinorhizobium meliloti أورثولوجس البروتين التي تتطابق بنسبة 58 ٪ على طول أطوالها الكاملة من حوالي 350 بقايا الأحماض الأمينية. مطلوب LpcC و LpB للتعايش مع نباتات PEA و Medicago، على التوالي. S. meliloti lpsB يكمل طفرة من R. leguminosarum معيبة inlpc، ولكن العكس لا يحدث. يشفر LpcC ناقلة مانوسيل انتقائية للغاية تستخدم مانوز الناتج المحلي الإجمالي لجليكوسيلات حمض 3 - deoxy - d - manno - octulosonic الداخلي (Kdo) المتبقي من سلائف عديد السكاريد الشحمي Kdo2 - lipid IVA. نثبت الآن أن LpsB يمكنه أيضًا معالجة نفس ركيزة المستقبل بكفاءة كما يفعل LpcC. ومع ذلك، بشكل غير متوقع، فإن انتقائية نوكليوتيدات السكر في LpsB مسترخية إلى حد كبير مقارنة بانتقائية LpcC. تحفز أغشية سلالة S. meliloti من النوع البري 2011 الارتباط الغليكوزي لـ Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA بمعدلات مماثلة باستخدام مجموعة متنوعة من نيوكليوتيدات السكر، بما في ذلك الناتج المحلي الإجمالي مانوز، ADP - مانوز، UDP - glucose، و ADP - glucose. هذا النمط المعقد من الجليكوزيلات يرجع بالكامل إلى LpsB، لأن أغشية S. meliloti lpsB mutant 6963 لا تحتوي على جليكوسيلات Kdo2 - [4 ′-32 P]دهون IVA في وجود أي من نيوكليوتيدات السكر هذه. يؤدي التعبير عن lpsB في E. coli باستخدام بنية يحركها T7lacpromoter إلى ظهور أنشطة نقل جليكوزيل متعددة مماثلة شوهدت في أغشية S. meliloti 2011. يبني التعبير عن lpcc عرض نشاط مانوسيل ترانسفيراز فقط. نستنتج أن LpsB، على الرغم من درجة تشابهه العالية مع LpcC، هو ناقلة جليكوسيل أكثر تنوعًا، وربما يفسر عدم قدرة lpc على تكملة طفرات Meliloti lpsB. النتائج التي توصلنا إليها لها آثار مهمة على تنظيم الجليكوزيلات الأساسية في S. meliloti والبكتيريا الأخرى التي تحتوي على LpcC orthologs. lipopolysaccharide 3 - deoxy - d - manno - octulosonic acid matrix - assisted laser desorption ionization time - of - flight كما هو موضح في الورقة السابقة (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar), Lpc of Rhizobium leguminosarum is a highly selective mannosyl transferase that uses the sugar nucleotide GDP - mannose for the enzymatic glycosylation of the acceptor Kdo2 - lipid IVA. تتوافق هذه النتائج مع الدراسات الهيكلية السابقة التي أجراها كارلسون وزملاؤه في العمل (2Bhat U.R. Krishnaiah B.S. Carlson RW Carbohydr. Res. 1991 ؛ 220: 219-227 Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar، 3Carlson RW Reuhs B. Chen TB Bhat UR Noel KDJ Biol. Chem. 1995; 270: 11783-11788 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar) مما يدل على أن المانوز هو السكر الوحيد المرتبط بمجموعة Kdo الداخلية من السكريات القليلة الأساسية من R. leguminosarum أو Rhizobium etlilipopolysaccharide (LPS)1(انظر الشكل 1 من الورقة السابقة). علاوة على ذلك، فإن طفرات R. leguminosarum التي تفتقر إلى lpc تعاني من نقص في نشاط إنزيم مانوسيل ترانسفيراز، وهي غير قادرة على تكوين عقيدات جذر وظيفية على بيزوم ساتيفيوم، وتوليف جزيء LPS مبتور يفتقر إلى بقايا السكر الأساسية المعتادة وراء ثنائي السكاريد Kdo (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan JT. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 1998 ؛ 273: 26432-26440 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (40) الباحث العلمي من Google). لم يتم الإبلاغ بعد عن الدراسات الهيكلية التفصيلية لجوهر LPS للسينورهيزوبيوم المليلوتي. 2R. كارلسون، التواصل الشخصي. قلب S. meliloti معقد، وقد يحتوي على بقايا الجلوكوز والجالاكتوز (5Campbell G.R. Reuhs B.L. Walker G.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. A. 2002; 99: 3938-3943 Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar).2 التسلسل الأخير لجينوم S. meliloti (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy - Hubler F. Barnett M. J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N. A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez - Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R. Jones Tahn D. Kahn M. L. Kalman S. Keating D. K. Kiss E. L. L. L. L. Lompure V. Masu D. P.C. Peckl P. P. T. T. T. P. P. P. P. P. Purnelle P. Ramurnger U. R. R. R. R. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. V. VEND. B. Boutry. Boutry M. B. Boutry M. K. K. K. K. K. K. K. K. H. K. K. K. K. K. H. K. K. K. K. K. K. K. K. K. H. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. K. 2001 ؛ 293: 668-672 Crossref PubMed Scopus (951) الباحث العلمي من Google) والدراسات الجينية المستقلة بواسطة Lagareset al. (7Lagares A. Hozbor DF Niehaus K. Otero AJ Lorenzen J. Arnold W. Puhler AJ Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 أظهر Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) أن الجين الذي يشفر تقويم العظام من Lpc موجود في S. meliloti. المسخ 6963، الذي يحتوي على إدخال Tn5 في هذا الجين (designatedlpsB)، معيب في التعايش مع Medicagospp. (8Lagares A. Caetano - Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H. D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ؛ 174: 5941-5952 Crossref PubMed Google Scholar، 9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. تفاعل الميكروبات النباتية. 1998 ؛ 11: 906-914 Crossref Scopus (65) الباحث العلمي من Google). في البداية، تبين أن الطفرة 6963 المستمدة من سلالة 2011 تتأخر في العقيدات وتتنافس بشكل سيئ على إشغال العقيدات على البرسيم (Medicago sativa) (8Lagares A. Caetano - Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ؛ 174: 5941-5952 Crossref PubMed Google Scholar). في دراسات لاحقة، وجد أن نفس الطفرة غير قادرة على تثبيت النيتروجين (Fix-) على ميديكاغو ترونكاتولا (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. تفاعل الميكروبات النباتية. 1998 ؛ 11: 906-914 Crossref Scopus (65) الباحث العلمي من Google). كما لوحظت علامات واضحة على دفاع النبات بنمط غير طبيعي من العدوى كما تم الحكم عليه من خلال الفحص المجهري الإلكتروني (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. تفاعل الميكروبات النباتية. 1998 ؛ 11: 906-914 Crossref Scopus (65) الباحث العلمي من Google). في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن أن متغيرات lpsB المستقلة المتولدة مع السلالة ذات الصلة S. meliloti 1021 هي Fix- في البرسيم. ومع ذلك، منذ عام 2011 و 1021 كلاهما مشتقان مقاومان للستربتومايسين من سلالة النوع البري SU47، فقد يكون النمط الظاهري المعيب لتثبيت النيتروجين الذي شوهد في البرسيم مع طفرة lpsB للسلالة 1021 هو نتيجة لكل من آفة lpsB وبعض الطفرات الأخرى غير المعروفة حتى الآن في 1021 الغائبة في سلالة 2011. مهما كان التفسير، فمن الواضح أن الطفرات المعيبة inlpsB توفر نظامًا نموذجيًا مثيرًا للاهتمام يمكن من خلاله التحقيق في مشاركة LPS في التعايش. كما هو موضح في الشكل 1، S. meliloti LpsB يبلغ طوله 351 بقايا حمض أميني ويعرض هوية 58 ٪ وتشابه 72 ٪ مع LpcC على الطول الكامل للبروتين بأكمله. وفقًا لذلك، من المتوقع أن يعمل LpsB، مثل R. leguminosarum LpcC، كناقلة مانوسيل. في الواقع، فإن جين ThelpsB قادر على استكمال اقتطاع مجموعة عديد السكاريد الشحمي ونقص العقدة الذي شوهد في سلالة RSKnH، وهي طفرة lpc من R. leguminosarum (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero AJ Lorenzen J. Arnold W. Puhler AJ Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، فإن lpcc غير قادر على استعادة تجميع عديد السكاريد الشحمي الطبيعي إلى S. meliloti lpsB mutant 6963 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler AJ Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). لفهم الأساس الكيميائي الحيوي لهذا الشذوذ الجيني، قمنا الآن بتمييز نشاط ناقلة الجليكوزيل لسلالة الوالدين S. meliloti 2011 و LPS الأساسية للتخليق الحيوي/نقص العقدة 6963. لقد استنسخنا أيضًا جين thelpsB خلف مروج T7lac وعبّرنا عنه في الإشريكية القولونية. تظهر النتائج بشكل قاطع أن LpsB، مثل LpcC، يمكن أن يعمل بمثابة ناقلة مانوسيل فعالة باستخدام GDP - mannose كمتبرع و Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA كركيزة متقبلة. ومع ذلك، على عكس LpcC، يظهر LpsB نشاطًا مشابهًا للعديد من نيوكليوتيدات السكر الأخرى، بما في ذلك ADP - glucose و UDP - glucose. قد تفسر هذه الأنشطة الإضافية لـ LpsB ملاحظة أن lpc لا يمكن أن تحل محل forlpsB في خلايا S. meliloti (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). تشير النتائج التي توصلنا إليها كذلك إلى أن أهم وظائف LpsB لبيولوجيا S. meliloti هي تلك المتعلقة باستخدام نيوكليوتيدات السكر بخلاف الناتج المحلي الإجمالي. يمكن الآن دراسة كيفية اكتساب بروتين LpsB لانتقائية نوكليوتيدات السكر المريحة عند مقارنته بـ LpcC على مستوى علم الإنزيمات والبنية. تم الحصول على نيوكليوتيدات السكر، Kdo، و HEPES من Sigma. تم شراء كواشف فحص Bicinchoninic و Triton X -100 من Pierce. كان مستخلص الخميرة والببتون- تريبتون من ديفكو. تم الحصول على 60 صفيحة كروماتوغرافية رقيقة من هلام السيليكا من شركة ميرك. تم شراء البيريدين والكلوروفورم والميثانول بدرجة الكاشف من VWR. [γ -32P] تم شراء ATP من PerkinElmer Life Sciences. يتم سرد السلالات البكتيرية والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة في TableI. تم وصف سلالات S. meliloti سابقًا (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A. J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). نمت سلالات S. meliloti في وسط TY (10 جم من كلوريد الصوديوم، و 10 جم من الببتون- تريبتون، و 5 جم من مستخلص الخميرة لكل لتر، مكملة بكلوريد الكالسيوم 10 مم) عند 30 درجة مئوية. عند الضرورة، تم استكمال المزارع أيضًا بالستربتومايسين (400 ميكروغرام/مل) و/أو النويميسين (30 ميكروغرام/مل). نمت سلالة الإشريكية القولونية BLR(DE3)/pLysS (Novagen) في مرق LB (تجارب 10Miller J.R. في علم الوراثة الجزيئية. مختبر كولد سبرينج هاربور، كولد سبرينج هاربور، نيويورك 1972 باحث جوجل) عند 37 درجة مئوية. الجدول ISinorhizobium meliloti السلالات والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة السلالات البكتيريةالنمط الجينيخصائص LPSالمصدر أو المرجعS. meliloti1021 نوع البرية الأبويةطول كاملRef.25Meade H.M. Long S.R. Ruvkun G.B. Brown S.E. Ausubel F.M. J Bacteriol. 1982 ؛ 149: 114-122 Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 2011 النوع البري الأبوي Full - lengthRef. 26 Casse F. Boucher C. Julliot JS Michell M. Dénarié JJ Gen. Microbiol. 1979 ؛ 113: 229-242 Crossref Scopus (345) Google ScholarS. meliloti6963lpsB::Tn5Truncated inner coreRef. 8Lagares A. Caetano - Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H. D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ؛ 174: 5941-5952 Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 6963 - BS. meliloti 6963 (pJBlpsSme) Full - lengthThis workS. meliloti6963 - CS. meliloti 6963 (pPN120)مقطوع كما في 6963 هذا العمل البلازميداتالخصائص ذات الصلةpJB3Tc19 مشتق من الحد الأدنى من نسخة طبق الأصل من البلازميد RK2، أبريل، TcrRef. 27Blatny J.M. Brautaset T. Winther - Larsen H.C. Haugan K. Valla S. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63: 370-379 Crossref PubMed Google ScholarpAL100pACYC184 - GM - MOB تحمل في Dral جزء من الحمض النووي SstI سعة 5.5 كيلو بايت من S. meliloti 2011 يأوي LPSBREF. 8Lagares A. Caetano - Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H. D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ؛ 174: 5941-5952 Crossref PubMed Google ScholarpJB1psSmepJB3Tc19 تحمل جزء SstI - HindIII بسعة 4.9 كيلو بايت مع المنطقةgreA - lpsB - lpsE - lpsD من S. meliloti 2011 المستنسخة في polylinker من المتجه بين EcoRI - HindIII، KmrRef. 7Lagares A. Hozbor DF Niehaus K. Otero AJ Lorenzen J. Arnold W. Puhler AJ Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google ScholarpPN120pLAFR -1 مع جزء EcoRI سعة 4.4 كيلو بايت يحتوي على greA، lpcC، dctA، ومنطقة 5'من dctB fromR. leguminosarum bv. viciae، TcrRefs. 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan JT Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar and7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) تم إعداد جدول Google Scholar Open في علامة تبويب جديدة Plasmids باستخدام مجموعة Qiagen Mini Prep Kit (Qiagen). تم استخدام إندو نوكلياز التقييد، وبوليميراز Pfu (Stratagene)، والفوسفاتيز القلوي الروبيان، و T4 ligase (Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركات المصنعة. تم تحضير الخلايا المختصة من E. coliwere للتحول باستخدام طريقة كلوريد الكالسيوم (11Bergmans H.E. van Die I.M. Hoekstra W.P. J. Bacteriol. 1981 ؛ 146: 564-570 Crossref PubMed Google Scholar,12Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor، Cold Spring Harbor، NY1989 الباحث العلمي من Google). تم إدخال البلازميدات في S. meliloti عن طريق الاقتران كما هو موضح سابقًا (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). تم تصميم برايمر PCR لاسترداد جين S. meliloti lpsB من البلازميد pAL100 (الجدول الأول) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google) وتقديم مواقع تقييد NdeI و BamHI في نهايات منتج PCR، كما هو موضح. تحتوي المواد الأولية المستخدمة للحصول على lpsB على التسلسلات التالية: FORWARD، 5′-GATTCCATATGTCGATATCCGCGACGTC -3 ′؛ REVERY، 5′- GATTCGGATCCTCAACGCATCAGTTTCGTAAAC-3′. كانت شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: 45 ثانية من التمسخ عند 98 درجة مئوية ثم 25 دورة من التمسخ (45 ثانية، 98 درجة مئوية)، التلدين (45 ثانية، 55 درجة مئوية)، والتمديد (1.5 دقيقة، 72 درجة مئوية). بعد الدورة الأخيرة، تم إجراء تمديد إضافي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. تم هضم منتج الحمض النووي للزوج 1056 - base الناتج مع إنزيمات تقييد NdeI و BamHI وربطه في ناقل تعبير، PET28b، الذي تم هضمه مع نفس الإنزيمات. تم استخدام خليط الربط الناتج لتحويل E. coli XL1 Blue، واختيار مقاومة الكانامايسين (30 ميكروغرام/مل). تم التحقق من وجود الإدخالات المناسبة في البلازميدات من عدة مستعمرات من خلال رسم خرائط التقييد. ثم تم نقل البنية المطلوبة، المعينة pMKRM، إلى E. coli BLR(DE3 )/ pLysS للتعبير غير المتجانس عالي المستوى عن lpsB. نمت سلالة الميليلوتي الموضحة في الجدول الأول من مستعمرة واحدة في 1 لتر من وسط TY الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة إلى كثافة بصرية تبلغ 600 = 1.4 (مرحلة التسجيل المتأخرة). تمت زراعة E. coli BLR(DE3 )/ pLysS/pMKRM من مستعمرة واحدة في 1 لتر من وسط LB يحتوي على 30 ميكروغرام/مل من الكلورامفينيكول و 30 ميكروغرام/مل من كاناميسين عند 37 درجة مئوية حتى وصل A 600 إلى 0.5. تم تحريض المزرعة باستخدام 1 مم أيزو بروبيل -1 - ثيو- β - d - galactopyranoside وتم تحضينها مع الاهتزاز لمدة 3 ساعات إضافية عند 30 درجة مئوية. تم حصاد الخلايا من المزارع المذكورة أعلاه بسعة 1 لتر عند 4 درجات مئوية عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق، وتم إعادة تعليق كل منها في 30 مل من 50 مم HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، وتم كسرها بممر واحد عبر خلية ضغط فرنسية عند 18000 رطل لكل بوصة مربعة. تمت إزالة الحطام وأجسام التضمين عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. تم تحضير الأغشية عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة. تم إعادة تعليق الأغشية في 20 مل من نفس المخزن المؤقت، وتم تكرار الطرد المركزي مرة ثانية عند 100000 ×جم لإزالة أي سيتوسول متبقي. تم تحديد تركيز البروتين بطريقة bicinchoninic (13Smith P.K. Krohn R.I. Hermanson G.T. Mallia A.K. Gartner F.H. Provenzano M.D. Fujimoto E.K. Goeke n.M. Olson B.J. Klenk D.C. Anal. Biochem. 1985 ؛ 150: 76-85 Crossref PubMed Scopus (19132) الباحث العلمي من Google) (Pierce). تم إعادة تعليق حبيبات الغشاء عند 10–15 ملغ من البروتين/مل في 50 مم هيبس، ودرجة الحموضة 7.5، وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تم فحص إنزيمات مانوسيل ترانسفيراز LpcC و LpsB باستخدام سلائف عديد السكاريد الشحمي Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA، والذي تم تصنيعه وعزله وتخزينه كتشتت مائي متجمد، كما هو موضح سابقًا (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 1999 ؛ 274: 11139-11149 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (38) الباحث العلمي من Google). قبل كل استخدام، تعرضت الركيزة الموسومة بالأشعة للإشعاع فوق الصوتي في حمام مائي لمدة دقيقة واحدة. تم فحص مانوسيل ترانسفيراز على النحو التالي. احتوى خليط التفاعل (الحجم النهائي 10 ميكرولتر) على 50 مم HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، و 0.1 ٪ Triton X -100، و 1 مم GDP - mannose، و 10 ميكرومتر Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA (3000–6000 cpm/nmol). بدأ التفاعل بإضافة كمية مناسبة من الإنزيم (عادة بتركيز نهائي قدره 1.0 مجم/مل من أغشية S. meliloti أو 0.02 مجم/مل من الأغشية المغسولة لخلايا E. coli overexpressinglpsB خلف معزز T7lac) وحضنت للأوقات المشار إليها عند 30 درجة مئوية. تم إيقاف التفاعلات عن طريق اكتشاف عينات 4 ميكرولتر مباشرة على لوحة طبقة رقيقة من هلام السيليكا. بعد تجفيف البقع في درجة حرارة الغرفة، تم تطوير اللوحة في الكلوروفورم المذيب، البيريدين، 88 ٪ حمض الفورميك، الماء (30:70:16:10، v/v/v/v). بعد إزالة المذيب بتيار الهواء الساخن، تم تحليل اللوحة باستخدام Amersham Biosciences PhosphorImager (Storm 840)، المجهز ببرنامج ImageQuant. تم فحص أنشطة ناقلة الجليكوزيل الأخرى لـ LpsB بنفس الطريقة ولكن في وجود نيوكليوتيدات السكر البديلة المشار إليها الموجودة عند 1 مم. تم استخراج LPS (أي Kdo2 - lipid A) من مزرعة 100 مل من خلايا الطور الجذعي المتأخر (OD = 1.4) مع خليط Bligh - Dyer أحادي الطور، يتكون من الكلوروفورم/الميثانول/الماء (1:2:0.8، v/v/v). بعد تقسيم المرحلة، تم تنقية LPS عن طريق اللوني على عمود DEAE - السليلوز، الذي تم إعداده في الكلوروفورم/الميثانول/الماء (2:3:1، v/v/v) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 2003 ؛ 278: 16356-16364 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (14) الباحث العلمي من Google). تم الحصول على الأطياف في الوضع السلبي باستخدام وقت الامتزاز/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI - TOF) Kompact 4 مطياف الكتلة (Kratos Analytical، مانشستر، المملكة المتحدة)، المجهز بليزر النيتروجين 337 نانومتر ويتم ضبطه على جهد استخراج 20 كيلو فولت. كانت الظروف هي نفسها كما هو موضح في الورقة السابقة (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 2003 ؛ 278: 16356-16364 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (14) الباحث العلمي من Google). كما هو موضح في الشكل 2 أ (الحارة 5)، أغشية R. leguminosarum 3841 (15Poole P.S. Schofield N.A. Reid C.J. Drew E.M. Walshaw D.L. Microbiology. 1994 ؛ 140: 2797-2809 Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar) glycosylateKdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA بطريقة انتقائية للغاية باستخدام GDP - mannose كركيزة مانحة مفضلة. النظير غير الفسيولوجي ADP - mannose، وهو منتج طبيعي موجود في الذرة (16Dankert M. Passeron S. Recondo E. Leloir L.F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1964; 14: 358-362 Crossref PubMed Scopus (10) Google Scholar, 17Passeron S. Recondo E. Dankert M. Biochim. Biophys. Acta. 1964; 89: 372-374 PubMed Google Scholar)، يمكن أن تحل محل GDP - mannose (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 1996 ؛ 271: 32119-32125 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (34) الباحث العلمي من Google)، وإن لم يكن بنفس الفعالية (الشكل. 2 أ،المسار 4). لا يمكن دمج السكريات الأساسية الأخرى قبل إضافة بقايا المانوز الأولى إلى Kdo2 - lipid IVA (البيانات غير موضحة) (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H.J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440 Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar, 19Brozek K.A. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32112-32118 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (41) Google Scholar). نشاط مانوسيل ترانسفيراز R. leguminosarumis الذي يحفزه LpcC، والذي يعرض نشاط ترانسفيراز قليل جدًا مع متبرعين آخرين بنوكليوتيدات السكر، مثل ADP - glucose أو UDP - glucose (الشكل 2 A, lanes 3 and 9, respectively) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar, 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 1998 ؛ 273: 26432-26440 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (40) الباحث العلمي من Google). في دراسات سابقة مع S. meliloti 1021 (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32119-32125 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar)، تم اكتشاف نشاط قليل أو معدوم لإنزيم مانوسيل ترانسفيراز في مستخلصات الخلايا أو الأغشية المحضرة من الخلايا المزروعة على وسط TY. لذلك تم استخدام خلايا S. meliloti 1021 للتعبير عن استنساخ وتوصيف lpc من R. leguminosarum (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. كيم. 1998 ؛ 273: 26432-26440 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (40) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، عندما تنمو بطريقة أكثر تحكمًا إلى مرحلة التسجيل المتأخرة، كما هو موضح أعلاه، فإن أغشية S. meliloti 1021 تحفز في الواقع المعالجة المانوية السريعة لـ Kdo2 - [4′-32 P]lipid IVA (الشكل 2 B، الممرات 12 و 13). ومن المثير للاهتمام، لوحظت جليكوسيلات أخرى من Kdo2 - [4′ -32P]lipid IVA مع أغشية S. meliloti 1021 (الشكل 2 B)، والتي غائبة في R. leguminosarum 3841 (الشكل 2 أ)، كما يُحكم من خلال تحول نطاق الركيزة المشعة إلى الأنواع المهاجرة ببطء أكبر باستخدام ADP - glucose و UDP - galactose و UDP - glucose (الشكل 2 ب، الحارات 11 و 14 و 17، على التوالي). حتى أن هناك تكوين بعض منتجات الجليكوزيل الثانوية من Kdo2 - [4′ -32P]lipid IVA مع ADP - glucose و UDP - galactose و UDP - glucose (الشكل 2 ب،الممرات 11 و 14 و 17)، والتي لا يتم رؤيتها عند استخدام ADP - mannose أو GDP - mannose كركائز للمانحين (الشكل 2 ب، الممران 12 و 13). في ظل الظروف المتطابقة، لا يدعم ADP - glucose و UDP - galactose و UDP - glucose أي غليكوزيل لـ Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA في أغشية R. leguminosarum 3841 (الشكل 2 أ) أو R. etli CE3 (البيانات غير موضحة). لا تحفز أغشية R. leguminosarum ولا S. meliloti 1021 عملية جليكوزيل فعالة لـ Kdo2 - [4′-32 P]lipid IVA مع UDP - GalUA أو UDP - GlcNAc كمتبرعين بالسكر (الشكل 2، A(الحارات 7 و 8) و B(الحارات 15 و 16)). يُعزى تكوين الفوسفات غير العضوي بواسطة أغشية R. leguminosarum إلى نشاط 4'- phosphatase، وهو غائب في S. meliloti (الشكل 2، أ مقابل ب) (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11139-11149 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar, 20Price N.J.P. Jeyaretnam B. Carlson R.W. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. Brozek K.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995 ؛ 92: 7352-7356 Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar). الجينوم المكتمل لـ S. meliloti 1021 (6Galibert F. Finan TM Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy - Hubler F. Barnett MJ Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.f. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez - Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman RW Jones T. Kahn D. Kahn M. Kalman S. Keating D. H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. Palm C. Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. The P. V. Vandenbolter FJ. Weidner S. WH. W. Wong W. Keh Kutc. 2001 ؛ 293: 668-672 Crossref PubMed Scopus (951) الباحث العلمي من Google) والدراسات الحديثة المثيرة للاهتمام حول S. meliloti متساوي المنشأ 2011 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero AJ Lorenzen J. Arnold W. Puhler AJ Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 كشف Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) عن وجود تقويم كبير من Lpc (هوية 58 ٪ وتشابه 72 ٪ على الطول الكامل للبروتين) في كل من هذه السلالات البكتيرية (الشكل 1). في حالة سلالة S. meliloti 2011، هذا أورثولوج Lpc (الذي كان يسمى LpsB) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler AJ Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) مطلوب لكل من تجميع السكريات قليلة السكاريد الأساسية والتعايش مع Medicago spp.، كما هو مقيم من خلال تحليل الطفرة 6963، والتي تحتوي على إدخال Tn5 في lpsB. لذلك قررنا فحص الارتباط السكري لـ Kdo2 -[4′-32P]lipid IVA باستخدام أغشية S. meliloti 2011 و mutant 6963. عندما يتم فحص أغشية S. meliloti 2011 عند 1 ملغ/مل لقدرتها على جليكوسيلات Kdo2 - [4′-32 P]الشحوم IVA، لوحظ في الأساس نفس النمط المعقد لإضافات السكر (الشكل 3) كما هو الحال مع S. meliloti 1021 الأغشية (الشكل 2 ب). عندما يتم فحص الأغشية المغسولة المماثلة من S. meliloti mutant 6963، لا يتم ملاحظة أي غليكوزيل لـ Kdo2 - [4 ′-32 P]lipid IVA من أي نوع (البيانات غير موضحة). تشير هذه النتيجة المذهلة إلى أن الجليكوزيلات المتنوعة التي تظهر في الشكلين 2 ب و 3 كلها نتيجة لإنزيم واحد مع انتقائية ركيزة نيوكليوتيد السكر المريحة، عند مقارنتها بـ LpcC. ومع ذلك، بناءً على هذه النتيجة وحدها، لا يمكن استبعاد نوع من التأثير التنظيمي متعدد الاتجاهات الثانوي لإدخال Tn5 في الجين lpsBgene للمتحول 6963. لقد وصفنا سابقًا البلازميدات pJBlpsSme، التي تحتوي على lpsB على جزء 4.9 كيلو بايت من الحمض النووي S. meliloti 2011، و pPN120، الذي يؤوي lpcC على جزء 4.4 كيلو بايت من الحمض النووي R. leguminosarum (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A. J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001 ؛ 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). كما هو موضح في الشكل 4، فإن إدخال أي من هذه البلازميدات في الطفرة 6963 (الحارات 4 و 5) يعيد نشاط مانوسيل ترانسفيراز الكامل، كما يتم الحكم عليه من خلال اختبار أغشية الخلايا مع Kdo2 - [4′-32 P]lipid IVA في وجود الناتج المحلي الإجمالي- mannose. في الواقع، يتم استعادة جميع الجليكوسيلات الأخرى من Kdo2 - [4′ -32P]lipid IVA أيضًا إلى الطفرة 6963 بواسطة plasmid pJBlpsSme (الشكل 5). على النقيض من ذلك، عندما يتم فحص الأغشية من الخلايا الطافرة 6963 التي تحتوي على lpc المحتوية على البلازميد pPN120 مع متبرعي نيوكليوتيدات السكر الآخرين (الشكل 6)، لا يظهر أي نشاط مع ADP - glucose أو UDP - galactose أو UDP - glucose، بما يتفق مع خصوصية الركيزة لأغشية R. leguminosarum الأصلية (الشكل 2 أ) و Lpc المنقى (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J Biol. كيم. 2003 ؛ 278: 16356-16364 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (14) الباحث العلمي من Google). تستبعد هذه النتائج (الشكل 6) إمكانية أن تقوم الإنزيمات الإضافية الموجودة في المستخلصات الخام لـ S. meliloti 2011 بتحويل جميع نيوكليوتيدات السكر المختلفة المضافة إلى نظام الفحص لمراعاة عمليات الجليكوزيل المتنوعة التي شوهدت في الأشكال 2 B, 3, and 5.Figure 5 استعادة تفاعلات جليكوسيلات Kdo2 - lipid IVA الأخرى في أغشية lpsBmutant 6963 التي تعبر عن S. meliloti lpsB. تم إجراء التفاعلات في ظل ظروف قياسية عند درجة الحموضة 7.5 باستخدام تركيز 1 مم من كل من نيوكليوتيدات السكر، كما هو موضح. تم استخدام الأغشية عند 1 ملغ/مل. تم إجراء الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. عرض عارض صور كبيرتحميل صورة عالية الدقة تنزيل (PPT)الشكل 6 لا Kdo2 - lipid IVAglycosylation مع السكريات بخلاف المانوز في أغشية lpsB mutant 6963 معبرًا عن R. leguminosarum lpc. تم إجراء التفاعلات في ظل ظروف قياسية عند درجة الحموضة 7.5 باستخدام تركيز 1 مم من كل من نيوكليوتيدات السكر، كما هو موضح. تم استخدام الأغشية كمصدر إنزيم عند 1 ملغ/مل. تم إجراء الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. عرض عارض صور كبيرتحميل صورة عالية الدقة تنزيل (PPT) تم استنساخ جين lpsB لـ S. meliloti 2011 خلف معزز T7lac للتعبير plasmid pET28b لتوليد pMKRM وتحويله إلى E. colistrain BLR(DE3)/pLysS. ثم تم فحص الأغشية المغسولة من الخلايا التي تم تحريضها في مرحلة التسجيل المتأخرة باستخدام الأيزوبروبيل -1 - ثيو- بيتا- د- جالاكتوبيرانوزيد لمدة 3 ساعات. كما هو موضح في الشكل 7 A(اللوحة العلوية)، أغشية الخلايا التي تأوي مكافحة ناقلات الأمراض (عند 0.02 ملغ/مل) تحفز القليل أو لا تحفز غليكوزيل Kdo2 - [4′-32P]Lipid IVA، مع

Translated Description (French)

Le gène lpcC de Rhizobium leguminosarum et le gène lpsB de Sinorhizobium meliloti codent des orthologues protéiques qui sont identiques à 58 % sur toute leur longueur d'environ 350 résidus d'acides aminés. LpcC et LpsB sont nécessaires pour la symbiose avec les plantes PEA et Medicago, respectivement. S. meliloti lpsBcomplète un mutant de R. leguminosarum défectueux inlpcC, mais l'inverse ne se produit pas. LpcC code pour une mannosyl transférase hautement sélective qui utilise le GDP-mannose pour glycosyler le résidu d'acide 3-désoxy-d-manno-octulosonique (Kdo) interne du précurseur lipopolysaccharidique Kdo2-lipide IVA. Nous démontrons maintenant que LpsB peut également mannosyler efficacement le même substrat accepteur que LpcC. De manière inattendue, cependant, la sélectivité en nucléotides de sucre de LpsB est considérablement assouplie par rapport à celle de LpcC. Les membranes de la souche sauvage S. meliloti 2011 catalysent la glycosylation du lipide Kdo2-[4′-32P] IVA à des vitesses comparables en utilisant un ensemble diversifié de nucléotides de sucre, y compris le GDP-mannose, l'ADP-mannose, l'UDP-glucose et l'ADP-glucose. Ce schéma complexe de glycosylation est entièrement dû à LpsB, puisque les membranes du mutant 6963 de S. meliloti lpsB ne glycosylent pas Kdo2-[4′-32P]lipide IVA en présence de l'un de ces nucléotides de sucre. L'expression de lpsB dans E. coli à l'aide d'une construction dirigée par un promoteur T7 entraîne l'apparition d'activités multiples similaires de glycosyl transférase observées dans les membranes de S. meliloti 2011. Les constructions exprimant lpcC n'affichent que l'activité de la mannosyl transférase. Nous concluons que la LpsB, malgré son haut degré de similitude avec la LpcC, est une glycosyltransférase beaucoup plus polyvalente, ce qui explique probablement l'incapacité de la lpcC à compléter les mutants de la lpsB meliloti. Nos résultats ont des implications importantes pour la régulation de la glycosylation du noyau chez S. meliloti et d'autres bactéries contenant des orthologues LpcC. Le gène lpcC de Rhizobium leguminosarum et le gène lpsB de Sinorhizobium meliloti codent des orthologues protéiques qui sont identiques à 58 % sur toute leur longueur d'environ 350 résidus d'acides aminés. LpcC et LpsB sont nécessaires pour la symbiose avec les plantes PEA et Medicago, respectivement. S. meliloti lpsBcomplète un mutant de R. leguminosarum défectueux inlpcC, mais l'inverse ne se produit pas. LpcC code pour une mannosyl transférase hautement sélective qui utilise le GDP-mannose pour glycosyler le résidu d'acide 3-désoxy-d-manno-octulosonique (Kdo) interne du précurseur lipopolysaccharidique Kdo2-lipide IVA. Nous démontrons maintenant que LpsB peut également mannosyler efficacement le même substrat accepteur que LpcC. De manière inattendue, cependant, la sélectivité en nucléotides de sucre de LpsB est considérablement assouplie par rapport à celle de LpcC. Les membranes de la souche sauvage de S. meliloti 2011 catalysent la glycosylation de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA à des vitesses comparables en utilisant un ensemble diversifié de nucléotides de sucre, y compris le GDP-mannose, l'ADP-mannose, l'UDP-glucose et l'ADP-glucose. Ce schéma complexe de glycosylation est entièrement dû à LpsB, puisque les membranes du mutant 6963 de S. meliloti lpsB ne glycosylent pas Kdo2-[4′-32P]lipide IVA en présence de l'un de ces nucléotides de sucre. L'expression de lpsB dans E. coli à l'aide d'une construction dirigée par un promoteur T7 entraîne l'apparition d'activités multiples similaires de glycosyl transférase observées dans les membranes de S. meliloti 2011. Les constructions exprimant lpcC n'affichent que l'activité de la mannosyl transférase. Nous concluons que la LpsB, malgré son haut degré de similitude avec la LpcC, est une glycosyltransférase beaucoup plus polyvalente, ce qui explique probablement l'incapacité de la lpcC à compléter les mutants de la lpsB meliloti. Nos résultats ont des implications importantes pour la régulation de la glycosylation du noyau chez S. meliloti et d'autres bactéries contenant des orthologues LpcC. lipopolysaccharide 3-désoxy-d-manno-octulosonique acide désorption-ionisation laser assistée par matrice temps de vol Comme le montre l'article précédent (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 16356-16364Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar), LpcC de Rhizobium leguminosarum est une mannosyl transférase hautement sélective qui utilise le nucléotide de sucre GDP-mannose pour la glycosylation enzymatique de l'accepteur Kdo2-lipide IVA. Ces résultats sont cohérents avec les études structurelles antérieures de Carlson et de ses collègues (2Bhat U.R. Krishnaiah B.S. Carlson R.W. Carbohydr. Res. 1991 ; 220: 219-227Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 3Carlson R.W. Reuhs B. Chen T.B. Bhat U.R. Noel K.D. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 11783-11788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar) démontrant que le mannose est le seul sucre attaché à la fraction Kdo interne de l'oligosaccharide de base de R. leguminosarum ou Rhizobium etlilipopolysaccharide (LPS)1(voir Fig. 1 de l'article précédent). De plus, les mutants de R. leguminosarum dépourvus de lpcC sont déficients en activité mannosyl transférase, sont incapables de former des nodules radiculaires fonctionnels sur Pisum sativum et synthétisent une molécule LPS tronquée dépourvue des résidus de sucre de base habituels au-delà du disaccharide Kdo (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). Des études structurelles détaillées du noyau LPS de Sinorhizobium meliloti n'ont pas encore été rapportées. 2R. Carlson, communication personnelle. Le noyau de S. meliloti est complexe et peut contenir des résidus de glucose et de galactose (5Campbell G.R. Reuhs B.L. Walker G.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002 ; 99: 3938-3943Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar).2 Le récent séquençage du génome de S. meliloti (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy-Hubler F. Barnett M.J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez-Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R.W. Jones T. Kahn D. Kahn M.L. Kalman S. Keating D.H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. Palm C. Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. Vandenbol M. Vorholter F.J. Weidner S. Wells D.H. Wong K. Yeh K.C. Batut Science J. 2001 ; 293: 668-672Crossref PubMed Scopus (951) Google Scholar) et des études génétiques indépendantes par Lagareset al. (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) ont démontré qu'un gène codant pour un orthologue de LpcC est présent chez S. meliloti. Le mutant 6963, qui héberge une insertion de Tn5 dans ce gène (désigné lpsB), est défectueux en symbiose avec Medicagospp. (8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google Scholar, 9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998 ; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Initialement, il a été démontré que le mutant 6963 dérivé de la souche 2011 était retardé dans la nodulation et peu compétitif pour l'occupation des nodules sur la luzerne (Medicago sativa) (8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google Scholar). Dans des études ultérieures, le même mutant s'est avéré incapable de fixer l'azote (Fix−) sur Medicago truncatula (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998 ; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Des signes évidents de défense des plantes ont également été observés avec un schéma anormal d'infection tel que jugé par microscopie électronique (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998 ; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Plus récemment, des mutants lpsB indépendants générés avec la souche apparentée S. meliloti 1021 ont été signalés comme étant Fix− dans la luzerne. Cependant, étant donné que 2011 et 1021 sont tous deux des dérivés résistants à la streptomycine de la souche de type sauvage SU47, il se peut que le phénotype de fixation d'azote défectueux observé chez la luzerne avec le mutant lpsB de la souche 1021 soit la conséquence à la fois de la lésion lpsB et d'une autre mutation encore non identifiée chez 1021 qui est absente dans la souche 2011. Quelle que soit l'explication, il est évident que les mutants défectueux inlpsB fournissent un système modèle intéressant avec lequel sonder la participation du LPS en symbiose. Comme le montre la Fig. 1, la LpsB de S. meliloti est longue de 351 résidus d'acides aminés et présente 58 % d'identité et 72 % de similitude avec la LpcC sur toute la longueur de la protéine entière. En conséquence, la LpsB, comme la LpcC de R. leguminosarum, devrait fonctionner comme une mannosyl transférase. Le gène ThelpsB est, en effet, capable de compléter la troncature de l'assemblage lipopolysaccharidique et le déficit de nodulation observés dans la souche RSKnH, un mutant lpcC de R. leguminosarum(7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Cependant, lpcC n'est pas en mesure de restaurer l'assemblage lipopolysaccharidique normal du mutant 6963 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Pour comprendre la base biochimique de cette anomalie génétique, nous avons maintenant caractérisé l'activité glycosyl transférase de la souche parentale S. meliloti 2011 et de son mutant 6963 déficient en biosynthèse/nodulation du noyau LPS. Nous avons également cloné le gène lpsB derrière le promoteur T7lac et l'avons exprimé chez Escherichia coli. Les résultats montrent de manière concluante que le LpsB, comme le LpcC, peut fonctionner comme une mannosyl transférase efficace en utilisant le GDP-mannose comme donneur et le Kdo2- [4′-32P]lipide IVA comme substrat accepteur. Cependant, contrairement à LpcC, LpsB montre une activité comparable avec plusieurs autres nucléotides de sucre, y compris l'ADP-glucose et l'UDP-glucose. Ces activités supplémentaires de LpsB peuvent expliquer l'observation selon laquelle lpcC ne peut pas remplacer lpsB dans les cellules de S. meliloti (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Nos résultats suggèrent en outre que les fonctions les plus importantes de LpsB pour la biologie de S. meliloti sont celles liées à l'utilisation des nucléotides du sucre autres que le GDP-mannose. La façon dont la protéine LpsB acquiert sa sélectivité en nucléotides de sucre détendue par rapport à LpcC peut maintenant être étudiée au niveau de l'enzymologie et de la structure. Les nucléotides de sucre, Kdo et HEPES ont été obtenus à partir de Sigma. Les réactifs de dosage bicinchoninique et le Triton X-100 ont été achetés chez Pierce. L'extrait de levure et la peptone-tryptone provenaient de Difco. Les plaques de chromatographie sur couche mince Silica Gel 60 ont été obtenues auprès de Merck. La pyridine, le chloroforme et le méthanol de qualité réactif ont été achetés auprès de VWR. [γ-32P]L'ATP a été acheté auprès de PerkinElmer Life Sciences. Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau I. Les souches de S. meliloti ont été décrites précédemment (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Les souches de S. meliloti ont été cultivées en milieu TY (10 g de NaCl, 10 g de peptone-tryptone et 5 g d'extrait de levure par litre, additionné de 10 mm de chlorure de calcium) à 30 °C. Si nécessaire, les cultures ont également été complétées avec de la streptomycine (400 μg/ml) et/ou de la néoymcine (30 μg/ml). La souche E. coli BLR(de3)/pLysS (Novagen) a été cultivée dans un bouillon LB (10Miller J.R. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1972Google Scholar) à 37 °C. Table ISinorhizobium meliloti strains and plasmids used in this studyBacterial strainsGenotypeLPS propertiesSource or referenceS. meliloti1021Parental wild typeFull-lengthRef.25Meade H.M. Long S.R. Ruvkun G.B. Brown S.E. Ausubel F.M. J. Bacteriol. 1982 ; 149: 114-122Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 2011Parental wild typeFull-lengthRef. 26Casse F. Boucher C. Julliot J.S. Michell M. Dénarié J. J. Gen. Microbiol. 1979 ; 113: 229-242Crossref Scopus (345) Google ScholarS. meliloti6963lpsB : :Tn5Truncated inner coreRef. 8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 6963-BS. meliloti 6963 (pJBlpsSme)Full-lengthThis workS. meliloti6963-CS. meliloti 6963 (pPN120)Truncated as in 6963This workPlasmidsRelevant characteristicspJB3Tc19Derivative of the minimal replicon of plasmid RK2, Apr, TcrRef. 27Blatny J.M. Brautaset T. Winther-Larsen H.C. Haugan K. Valla S. Appl. Environ. Microbiol. 1997 ; 63: 370-379Crossref PubMed Google ScholarpAL100pACYC184-Gm-mob carrying in Dral a 5.5-kb SstI DNA fragment from S. meliloti 2011 harboring lpsBRef. 8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992 ; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google ScholarpJB1psSmepJB3Tc19 portant un fragment SstI-HindIII de 4,9 kb avec le regiongreA-lpsB-lpsE-lpsD de S. meliloti 2011 cloné dans le polylinker du vecteur entreEcoRI-HindIII, KmrRef. 7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google ScholarpPN120pLAFR-1 with a 4.4 kb EcoRI fragment containinggreA, lpcC, dctA, and the 5′ region of dctB fromR. leguminosarum bv. viciae, TcrRefs. 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 26432-26440Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar and7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar Table ouverte dans un nouvel onglet Les plasmides ont été préparés à l'aide du Qiagen Mini Prep Kit (Qiagen). Les endonucléases de restriction, la polymérase Pfu (Stratagene), la phosphatase alcaline de crevette et la ligase T4 (Invitrogen) ont été utilisées selon les instructions du fabricant. Des cellules compétentes d'E. coli ont été préparées pour la transformation en utilisant la méthode du chlorure de calcium (11Bergmans H.E. van Die I.M. Hoekstra W.P. J. Bacteriol. 1981 ; 146: 564-570Crossref PubMed Google Scholar,12Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). L'introduction de plasmides dans S. meliloti a été réalisée par conjugaison comme décrit précédemment (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Les amorces PCR ont été conçues pour récupérer le gène lpsB de S. meliloti du plasmide pAL100 (Tableau I) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) et d'introduire des sites de restriction NdeI et BamHI aux extrémités du produit PCR, comme indiqué. Les amorces utilisées pour obtenir lpsB ont les séquences suivantes : forward, 5'-GAATTCCATATGGTCGATATCCGCGACGTC-3' ; reverse, 5'-GAATTCGGATCCTCAACGCATCAGGCTTTCGTAAAC-3'. Les conditions de la PCR étaient les suivantes : 45 s de dénaturation à 98 °C, puis 25 cycles de dénaturation (45 s, 98 °C), de recuit (45 s, 55 °C) et d'extension (1,5 min, 72 °C). Après le dernier cycle, une extension supplémentaire de 10 minutes à 72 °C a été effectuée. Le produit d'ADN de 1056 paires de bases résultant a été digéré avec les enzymes de restriction NdeI et BamHI et ligaturé dans un vecteur d'expression, pET28b, qui avait été digéré avec les mêmes enzymes. Le mélange de ligature résultant a été utilisé pour transformer E. coli XL1 Blue, en sélectionnant la résistance à la kanamycine (30 μg/ml). La présence des inserts appropriés dans les plasmides de plusieurs colonies a été vérifiée par cartographie de restriction. La construction souhaitée, désignée pMKRM, a ensuite été transférée dans E. coli BLR(de3)/pLysS pour une expression hétérologue de haut niveau de lpsB. La souche EachS. meliloti présentée dans le tableau I a été cultivée à partir d'une seule colonie dans 1 litre de milieu TY contenant les antibiotiques appropriés jusqu'à une densité optique de 600 = 1,4 (phase logarithmique tardive). E. coli BLR(de3)/pLysS/pMKRM a été cultivé à partir d'une seule colonie dans 1 litre de milieu LB contenant 30 μg/ml de chloramphénicol et 30 μg/ml de kanamycine à 37 °C jusqu'à ce que l'A 600 atteigne ∼0,5. La culture a été induite avec 1 mmisopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside et incubée sous agitation pendant 3 h supplémentaires à 30 °C. Les cellules des cultures de 1 litre ci-dessus ont été récoltées à 4 °C par centrifugation à 4 000 × g pendant 10 min, ont été chacune remises en suspension dans 30 ml d'HEPES 50 mm, pH 7,5, et ont été brisées par un passage à travers une cellule de pression française à 18 000 p.s.i. Les débris et les corps d'inclusion ont été éliminés par centrifugation à 4 000 × g pendant 15 min. Les membranes ont été préparées par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 60 min. Les membranes ont été remises en suspension dans 20 ml du même tampon, et la centrifugation a été répétée une deuxième fois à 100 000 xg pour éliminer tout cytosol restant. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode bicinchoninique (13Smith P.K. Krohn R.I. Hermanson G.T. Mallia A.K. Gartner F.H. Provenzano M.D. Fujimoto E.K. Goeke N.M. Olson B.J. Klenk D.C. Anal. Biochem. 1985 ; 150: 76-85Crossref PubMed Scopus (19132) Google Scholar) (Pierce). Le culot membranaire a été remis en suspension à 10–15 mg de protéine/ml dans 50 mmHEPES, pH 7,5, et conservé à −80 °C jusqu'à utilisation ultérieure. Les mannosyl transférases LpcC et LpsB ont été dosées en utilisant le précurseur lipopolysaccharidique Kdo2- [4′-32P]lipide IVA, qui a été synthétisé, isolé et stocké sous forme de dispersion aqueuse congelée, comme décrit précédemment (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 11139-11149Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar). Avant chaque utilisation, le substrat radiomarqué a été soumis à une irradiation ultrasonore dans un bain-marie pendant 1 min. La mannosyl transférase a été dosée comme suit. Le mélange réactionnel (volume final de 10 μl) contenait 50 mm d'HEPES, pH 7,5, 0,1 % de Triton X-100, 1 mm de GDP-mannose et 10 μm de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA (3000–6000 cpm/nmol). La réaction a été déclenchée par l'ajout d'une quantité appropriée d'enzyme (généralement à une concentration finale de 1,0 mg/ml de membranes de S. meliloti ou 0,02 mg/ml de membranes lavées de cellules d'E. coli surexprimant lpsB derrière le promoteur T7lac) et incubée pendant les temps indiqués à 30 °C. Les réactions ont été arrêtées en repérant des échantillons de 4 μl directement sur une plaque en couche mince de gel de silice. Après séchage des taches à température ambiante, la plaque a été développée dans le solvant chloroforme, pyridine, acide formique à 88%, eau (30:70:16:10, v/v/v/v/v). Après élimination du solvant avec un flux d'air chaud, la plaque a été analysée à l'aide d'un PhosphorImager d'Amersham Biosciences (Storm 840), équipé du logiciel ImageQuant. D'autres activités glycosyl transférase de LpsB ont été dosées de la même manière mais en présence des nucléotides sucrés alternatifs indiqués présents à 1 mm. Le LPS (c'est-à-dire le Kdo2-lipide A) a été extrait d'une culture de 100 ml de cellules en phase logarithmique tardive (DO = 1,4) avec un mélange Bligh-Dyer monophasé, composé de chloroforme/méthanol/eau (1:2:0,8, v/v/v). Après partitionnement de phase, le LPS a été purifié par chromatographie sur colonne DEAE-cellulose, préparé dans chloroforme/méthanol/eau (2:3:1, v/v/v) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Les spectres ont été acquis en mode négatif à l'aide d'un spectromètre de masse Kompact 4 à désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) (Kratos Analytical, Manchester, Royaume-Uni), équipé d'un laser à azote de 337 nm et réglé à une tension d'extraction de 20 kV. Les conditions étaient les mêmes que celles décrites dans l'article précédent (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Comme le montre la Fig.2 A (voie 5), membranes de R. leguminosarum 3841 (15Poole P.S. Schofield N.A. Reid C.J. Drew E.M. Walshaw D.L. Microbiologie. 1994 ; 140: 2797-2809Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar) glycosylate Kdo2-[4′-32P]lipid IVA de manière très sélective en utilisant le GDP-mannose comme substrat donneur préféré. L'analogue non physiologique ADP-mannose, produit naturel présent dans le maïs (16Dankert M. Passeron S. Recondo E. Leloir L.F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1964 ; 14: 358-362Crossref PubMed Scopus (10) Google Scholar, 17Passeron S. Recondo E. Dankert M. Biochim. Biophys. Acta. 1964 ; 89: 372-374PubMed Google Scholar), peut remplacer le GDP-mannose (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996 ; 271: 32119-32125Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar), mais pas aussi efficacement (Fig. 2 A,voie 4). D'autres sucres de base ne peuvent pas être incorporés avant l'ajout du premier résidu de mannose à Kdo2-lipid IVA (données non présentées) (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 26432-26440Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar, 19Brozek K.A. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996 ; 271: 32112-32118Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (41) Google Scholar). L'activité mannosyl transférase de R. leguminosarum est catalysée par la LpcC, qui présente très peu d'activité transférase avec d'autres donneurs de nucléotides sucrés, tels que l'ADP-glucose ou l'UDP-glucose (Fig. 2 A, voies 3 et 9, respectivement) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 16356-16364Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar, 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). Dans des études antérieures avec S. meliloti 1021 (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996 ; 271: 32119-32125Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar), peu ou pas d'activité mannosyl transférase a été détectée dans des extraits cellulaires ou des membranes préparés à partir de cellules cultivées sur milieu TY. S. meliloti 1021 cellules ont donc été utilisées pour l'expression clonage et la caractérisation de lpcC à partir de R. leguminosarum (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). Cependant, lorsqu'elles sont cultivées de manière plus contrôlée jusqu'à la phase logarithmique tardive, comme décrit ci-dessus, les membranes de S. meliloti 1021 catalysent en fait la mannosylation rapide de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA (Fig.2 B, voies 12 et 13). Fait intéressant, d'autres glycosylations de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA sont observées avec des membranes de S. meliloti 1021 (Fig.2 B), qui sont absentes chez R. leguminosarum 3841 (Fig. 2 A), comme en témoigne le déplacement de la bande de substrat radioactif vers des espèces à migration plus lente avec de l'ADP-glucose, de l'UDP-galactose et de l'UDP-glucose (Fig. 2 B, voies 11, 14 et 17, respectivement). Il y a même la formation de certains produits de glycosylation secondaires deKdo2- [4′-32P]lipide IVA avec l'ADP-glucose, l'UDP-galactose et l'UDP-glucose (Fig. 2 B,voies 11, 14 et 17), qui ne sont pas visibles lorsque l'ADP-mannose ou le GDP-mannose sont utilisés comme substrats donneurs (Fig. 2 B, voies 12 et 13). Dans des conditions appariées, l'ADP-glucose, l'UDP-galactose et l'UDP-glucose ne supportent aucune glycosylation de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA dans les membranes de R. leguminosarum 3841 (Fig.2 A) ou R. etli CE3 (données non présentées). Ni les membranes de R. leguminosarum ni celles de S. meliloti 1021 ne catalysent la glycosylation efficace de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA avec UDP-GalUA ou UDP-GlcNAc comme donneurs de sucre (Fig. 2, A(voies 7 et 8) et B(voies 15 et 16)). La formation de phosphate inorganique par les membranes de R. leguminosarum est attribuée à l'activité 4′-phosphatase, qui est absente chez S. meliloti (Fig. 2, A contre B) (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 11139-11149Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar, 20Price N.J.P. Jeyaretnam B. Carlson R.W. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. Brozek K.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995 ; 92: 7352-7356Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar). Le génome complet de S. meliloti 1021 (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy-Hubler F. Barnett M.J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez-Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R.W. Jones T. Kahn D. Kahn M.L. Kalman S. Keating D.H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. Palm C. Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. Thebault P. Vandenbol M. Vorholter F.J. Weidner S. Wells D.H. Wong K. Yeh K.C. Batut J. Science. 2001 ; 293: 668-672Crossref PubMed Scopus (951) Google Scholar) et des études récentes intrigantes sur l'isogénique S. meliloti 2011 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) ont révélé la présence d'un orthologue significatif de LpcC (58% d'identité et 72% de similitude sur toute la longueur de la protéine) dans ces deux souches bactériennes (Fig. 1). Dans le cas de la souche S. meliloti 2011, cet orthologue LpcC (qui a été appelé LpsB) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) est nécessaire à la fois pour l'assemblage des oligosaccharides de base et pour la symbiose avec Medicago spp., comme en témoigne l'analyse du mutant 6963, qui contient une insertion de Tn5 dans lpsB. Nous avons donc décidé d'examiner la glycosylation du Kdo2-[4′-32P]lipide IVA en utilisant des membranes de S. meliloti 2011 et du mutant 6963. Lorsque les membranes de S. meliloti 2011 sont dosées à 1 mg/ml pour leur capacité à glycosyler le Kdo2- [4′-32P]lipide IVA, on observe essentiellement le même schéma complexe d'additions de sucre (Fig. 3) qu'avec les membranes de S. meliloti 1021 (Fig. 2 B). Lorsque des membranes lavées comparables de S. meliloti mutant 6963 sont testées, aucune glycosylation de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA de quelque nature que ce soit n'est observée (données non présentées). Ce résultat frappant suggère que les diverses glycosylations observées dans les Figures 2 B et 3 sont toutes le résultat d'une seule enzyme avec une sélectivité relâchée du substrat nucléotidique du sucre, par contraste avec la LpcC. Sur la base de cette seule constatation, cependant, une sorte d'effet régulateur pléiotrope secondaire à l'insertion de Tn5 dans le gène lpsB du mutant 6963 ne peut être exclu. Nous avons précédemment décrit les plasmides pJBlpsSme, qui contient lpsB sur un fragment de 4,9 kb d'ADN de S. meliloti 2011, et pPN120, qui héberge lpcC sur un fragment de 4,4 kb d'ADN de R. leguminosarum (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001 ; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Comme le montre la figure 4, l'introduction de l'un ou l'autre de ces plasmides dans le mutant 6963 (voies 4 et 5) restaure l'activité complète de la mannosyl transférase, comme en témoigne le dosage des membranes cellulaires avec Kdo2- [4′-32P]lipide IVA en présence de GDP-mannose. En fait, toutes les autres glycosylations de Kdo2- [4′-32P]lipide IVA sont également restaurées au mutant 6963 par le plasmide pJBlpsSme (Fig.5). En revanche, lorsque les membranes de cellules 6963 mutantes hébergeant le plasmide pPN120 contenant lpcC sont dosées avec les autres donneurs de nucléotides de sucre (Fig.6), aucune activité n'est observée avec l'ADP-glucose, l'UDP-galactose ou l'UDP-glucose, en accord avec la spécificité du substrat des membranes natives de R. leguminosarum (Fig.2 A) et de LpcC purifiée (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Ces résultats (Fig. 6) excluent la possibilité que des enzymes supplémentaires présentes dans des extraits bruts de S. meliloti 2011 interconvertissent tous les divers nucléotides de sucre ajoutés au système de dosage pour tenir compte des diverses glycosylations observées dans les Figs. 2 B, 3 et 5. Figure 5Restauration d'autres réactions de glycosylation de Kdo2-lipide IVA dans les membranes de lpsBmutant 6963 exprimant S. meliloti lpsB. Les réactions ont été effectuées dans des conditions standard à pH 7,5 en utilisant une concentration de 1 mm de chacun des nucléotides du sucre, comme indiqué. Des membranes ont été utilisées à 1 mg/ml. L'incubation a été réalisée à 30 °C pendant 60 min. Voir la visionneuse de grandes images Télécharger l'image haute résolution Télécharger (PPT)Figure 6No Kdo2-lipid IVAglycosylation avec des sucres autres que le mannose dans les membranes du mutant 6963 de lpsB exprimant R. leguminosarum lpcC. Les réactions ont été effectuées dans des conditions standard à pH 7,5 en utilisant une concentration de 1 mm de chacun des nucléotides du sucre, comme indiqué. Des membranes ont été utilisées comme source d'enzyme à 1 mg/ml. L'incubation a été réalisée à 30°C pendant 60 min.Voir Visionneuse Figure Grande ImageTélécharger l'image Hi-res Download (PPT) Le gène lpsB de S. meliloti 2011 a été cloné derrière le promoteur T7lac du plasmide d'expression pET28b pour générer pMKRM et transformé en E. colistrain BLR(de3)/pLysS. Les membranes lavées ont ensuite été dosées à partir de cellules qui avaient été induites en phase logarithmique tardive avec l'isopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside pendant 3 h. Comme le montre la Fig. 7 A(panneau supérieur), les membranes des cellules abritant le contrôle du vecteur (à 0,02 mg/ml) catalysent peu ou pas de glycosylation deKdo2- [4′-32P]lipide IVA, avec

Translated Description (Spanish)

El gen lpcC de Rhizobium leguminosarum y el gen lpsB de Sinorhizobium meliloti codifican ortólogos de proteínas que son 58% idénticos en sus longitudes completas de aproximadamente 350 residuos de aminoácidos. LpcC y LpsB son necesarios para la simbiosis con plantas de guisante y Medicago, respectivamente. S. meliloti lpsB complementa un mutante de R. leguminosarum defectuoso en lpcC, pero no ocurre lo contrario. LpcC codifica una manosil transferasa altamente selectiva que utiliza GDP-manosa para glicosilar el residuo interno de ácido 3-desoxi-d-mano-octulosónico (Kdo) del precursor de lipopolisacárido Kdo2-lípido IVA. Ahora demostramos que LpsB también puede manosilar eficientemente el mismo sustrato aceptor que LpcC. Sin embargo, inesperadamente, la selectividad de nucleótidos de azúcar de LpsB está muy relajada en comparación con la de LpcC. Las membranas de la cepa 2011 de S. meliloti de tipo salvaje catalizan la glicosilación de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA a tasas comparables utilizando un conjunto diverso de nucleótidos de azúcar, que incluyen GDP-manosa, ADP-manosa, UDP-glucosa y ADP-glucosa. Este patrón complejo de glicosilación se debe completamente a LpsB, ya que las membranas del mutante 6963 de lpsB de S. meliloti no glicosilan el lípido IVA Kdo2- [4′-32P] en presencia de ninguno de estos nucleótidos de azúcar. La expresión de lpsB en E. coli utilizando una construcción dirigida por el promotor T7lac da como resultado la aparición de múltiples actividades de glicosil transferasa similares observadas en las membranas de S. meliloti 2011. Los constructos que expresan lpcC muestran solo actividad manosil transferasa. Concluimos que LpsB, a pesar de su alto grado de similitud con LpcC, es una glicosiltransferasa mucho más versátil, lo que probablemente explica la incapacidad de lpcC para complementar los mutantes lpsB de S. meliloti. Nuestros hallazgos tienen implicaciones importantes para la regulación de la glicosilación central en S. meliloti y otras bacterias que contienen ortólogos de LpcC. El gen lpcC de Rhizobium leguminosarum y el gen lpsB de Sinorhizobium meliloti codifican ortólogos de proteínas que son 58% idénticos en sus longitudes completas de aproximadamente 350 residuos de aminoácidos. LpcC y LpsB son necesarios para la simbiosis con plantas de guisante y Medicago, respectivamente. S. meliloti lpsB complementa un mutante de R. leguminosarum defectuoso en lpcC, pero no ocurre lo contrario. LpcC codifica una manosil transferasa altamente selectiva que utiliza GDP-manosa para glicosilar el residuo interno de ácido 3-desoxi-d-mano-octulosónico (Kdo) del precursor de lipopolisacárido Kdo2-lípido IVA. Ahora demostramos que LpsB también puede manosilar eficientemente el mismo sustrato aceptor que LpcC. Sin embargo, inesperadamente, la selectividad de nucleótidos de azúcar de LpsB está muy relajada en comparación con la de LpcC. Las membranas de la cepa 2011 de S. meliloti de tipo salvaje catalizan la glicosilación de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA a tasas comparables utilizando un conjunto diverso de nucleótidos de azúcar, que incluyen GDP-manosa, ADP-manosa, UDP-glucosa y ADP-glucosa. Este patrón complejo de glicosilación se debe completamente a LpsB, ya que las membranas del mutante 6963 de lpsB de S. meliloti no glicosilan el lípido IVA Kdo2- [4′-32P] en presencia de ninguno de estos nucleótidos de azúcar. La expresión de lpsB en E. coli utilizando una construcción dirigida por el promotor T7lac da como resultado la aparición de múltiples actividades de glicosil transferasa similares observadas en las membranas de S. meliloti 2011. Los constructos que expresan lpcC muestran solo actividad manosil transferasa. Concluimos que LpsB, a pesar de su alto grado de similitud con LpcC, es una glicosiltransferasa mucho más versátil, lo que probablemente explica la incapacidad de lpcC para complementar los mutantes lpsB de S. meliloti. Nuestros hallazgos tienen implicaciones importantes para la regulación de la glicosilación del núcleo en S. meliloti y otras bacterias que contienen ortólogos de LpcC. lipopolisacárido ácido 3-desoxi-d-mano-octulosónico asistido por matriz de ionización por desorción láser tiempo de vuelo Como se muestra en el artículo anterior (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar), LpcC de Rhizobium leguminosarum es una manosil transferasa altamente selectiva que utiliza el nucleótido de azúcar GDP-manosa para la glicosilación enzimática del aceptor Kdo2-lípido IVA. Estos hallazgos son consistentes con estudios estructurales anteriores de Carlson y sus compañeros de trabajo (2Bhat U.R. Krishnaiah B.S. Carlson R.W. Carbohydr. Res. 1991; 220: 219-227Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 3Carlson R.W. Reuhs B. Chen T.B. Bhat U.R. Noel K.D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 11783-11788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar) que demuestra que la manosa es el único azúcar unido al resto Kdo interno del oligosacárido central de R. leguminosarum o Rhizobium etlilipopolysaccharide (LPS)1(véase la Fig. 1 del artículo anterior). Además, los mutantes de R. leguminosarum que carecen de lpcC son deficientes en actividad manosil transferasa, no pueden formar nódulos radiculares funcionales en Pisum sativum y sintetizan una molécula de LPS truncada que carece de los residuos de azúcar centrales habituales más allá del disacárido Kdo (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). Aún no se han informado estudios estructurales detallados del núcleo de LPS de Sinorhizobium meliloti. 2R. Carlson, comunicación personal. El núcleo de S. meliloti es complejo y puede contener residuos de glucosa y galactosa (5Campbell G.R. Reuhs B.L. Walker G.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 3938-3943Crossref PubMed Scopus (119) Google Scholar).2 La reciente secuenciación del genoma de S. meliloti (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy-Hubler F. Barnett M.J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez-Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R.W. Jones T. Kahn D. Kahn M.L. Kalman S. Keating D.H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. C. Palm Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. Thebault P. Vandenbol M. Vorholter F.J. Weidner S.D. Wells D.H. Wong K.H. Batut J. K. K. Science. 2001; 293: 668-672 Crossref PubMed Scopus (951) Google Scholar) y estudios genéticos independientes de Lagareset al. (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) han demostrado que un gen que codifica un ortólogo de LpcC está presente en S. meliloti. El mutante 6963, que alberga una inserción de Tn5 en este gen (designado lpsB), es defectuoso en simbiosis con Medicagospp. (8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google Scholar, 9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Inicialmente, se demostró que el mutante 6963 derivado de la cepa 2011 retrasaba la nodulación y era poco competitivo para la ocupación de nódulos en la alfalfa (Medicago sativa) (8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952 Crossref PubMed Google Scholar). En estudios posteriores, se descubrió que el mismo mutante no podía fijar nitrógeno (Fix−) enMedicago truncatula (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). También se observaron signos claros de defensa de la planta con un patrón anormal de infección a juzgar por microscopía electrónica (9Niehaus K. Lagares A. Pühler A. Mol. Plant Microbe Interact. 1998; 11: 906-914Crossref Scopus (65) Google Scholar). Más recientemente, se informó que los lpsBmutantes independientes generados con la cepa relacionada S. meliloti 1021 eran Fix− en alfalfa. Sin embargo, dado que 2011 y 1021 son derivados resistentes a la estreptomicina de la cepa de tipo salvaje SU47, puede ser que el fenotipo de fijación de nitrógeno defectuoso observado en la alfalfa con el mutante lpsB de la cepa 1021 sea la consecuencia tanto de la lesión lpsB como de alguna otra mutación aún no identificada en 1021 que está ausente en la cepa 2011. Cualquiera que sea la explicación, es evidente que los mutantes defectuosos inlpsB proporcionan un sistema modelo interesante con el que sondear la participación de LPS en la simbiosis. Como se muestra en la Fig. 1, S. meliloti LpsB tiene 351 residuos de aminoácidos de longitud y muestra 58% de identidad y 72% de similitud con LpcC en toda la longitud de la proteína completa. Por consiguiente, se esperaría que LpsB, como R. leguminosarum LpcC, funcionara como una manosil transferasa. El gen ThelpsB es, de hecho, capaz de complementar el truncamiento del ensamblaje de lipopolisacáridos y la deficiencia de nodulación observada en la cepa RSKnH, un mutante lpcC de R. leguminosarum(7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A. J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Sin embargo, lpcC no puede restaurar el ensamblaje normal de lipopolisacáridos al mutante 6963 de lpsB de S. meliloti (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Para comprender la base bioquímica de esta anomalía genética, ahora hemos caracterizado la actividad glicosil transferasa de la cepa parental S. meliloti 2011 y su mutante 6963 deficiente en biosíntesis/nodulación del núcleo de LPS. También hemos clonado el gen lpsB detrás del promotor T7lac y lo hemos expresado en Escherichia coli. Los resultados muestran de manera concluyente que LpsB, como LpcC, puede funcionar como una manosil transferasa eficaz utilizando GDP-manosa como donante yKdo2- [4′-32P]lípido IVA como sustrato aceptor. Sin embargo, a diferencia de LpcC, LpsB muestra una actividad comparable con varios otros nucleótidos de azúcar, incluyendo ADP-glucosa y UDP-glucosa. Estas actividades adicionales de LpsB pueden explicar la constatación de que lpcC no puede sustituir a lpsB en células de S. meliloti (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Nuestros hallazgos sugieren además que las funciones más importantes de LpsB para la biología de S. meliloti son aquellas relacionadas con la utilización de los nucleótidos de azúcar distintos de GDP-manosa. La forma en que la proteína LpsB adquiere su selectividad de nucleótidos de azúcar relajado en comparación con LpcC ahora se puede estudiar a nivel de enzimología y estructura. Los nucleótidos de azúcar, Kdo y HEPES se obtuvieron de Sigma. Los reactivos de ensayo bicinconínicos y Triton X-100 se adquirieron de Pierce. El extracto de levadura y la peptona-triptona eran de Difco. Las placas de cromatografía de capa fina de gel de sílice 60 se obtuvieron de Merck. La piridina, el cloroformo y el metanol de grado reactivo se adquirieron de VWR. El [γ-32P]ATP se adquirió de PerkinElmer Life Sciences. Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla I. Las cepas de S. meliloti se han descrito previamente (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Las cepas de S. meliloti se cultivaron en medio TY (10 g de NaCl, 10 g de peptona-triptona y 5 g de extracto de levadura por litro, complementado con cloruro de calcio 10 mm) a 30 °C. Cuando fue necesario, los cultivos también se complementaron con estreptomicina (400 μg/ml) y/o neoymcina (30 μg/ml). La cepa de E. coli BLR(DE3)/pLysS (Novagen) se cultivó en caldo LB (10Miller J.R. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1972Google Scholar) a 37 °C. Tabla Cepas y plásmidos de ISinorhizobium meliloti utilizados en este estudioCepas bacterianasGenotipoPropiedades de LPSFuente o referenciaS. meliloti1021Parental wild typeFull-lengthRef.25Meade H.M. Long S.R. Ruvkun G.B. Brown S.E. Ausubel F.M. J. Bacteriol. 1982; 149: 114-122Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 2011Parental wild typeFull-lengthRef. 26Casse F. Boucher C. Julliot J.S. Michell M. Dénarié J. J. Gen. Microbiol. 1979; 113: 229-242Crossref Scopus (345) Google ScholarS. meliloti6963lpsB::Tn5Núcleo interno truncadoRef. 8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google ScholarS. meliloti 6963-BS. meliloti 6963 (pJBlpsSme)Longitud completaEste trabajoS. meliloti6963-CS. meliloti 6963 (pPN120)Truncado como en 6963Este trabajoPlásmidosCaracterísticas relevantespJB3Tc19Derivada del replicón mínimo del plásmido RK2, Apr, TcrRef. 27Blatny J.M. Brautaset T. Winther-Larsen H.C. Haugan K. Valla S. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63: 370-379Crossref PubMed Google ScholarpAL100pACYC184-Gm-mob que transporta en Dral un fragmento de ADN SstI de 5,5 kb de S. meliloti 2011 que alberga lpsBRef. 8Lagares A. Caetano-Anolles G. Niehaus K. Lorenzen J. Ljunggren H.D. Puhler A. Favelukes G. J. Bacteriol. 1992; 174: 5941-5952Crossref PubMed Google ScholarpJB1psSmepJB3Tc19 que lleva un fragmento SstI-HindIII de 4,9 kb con el regiongreA-lpsB-lpsE-lpsD de S. meliloti 2011 clonado en el polienlazador del vector entreEcoRI-HindIII, KmrRef. 7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google ScholarpPN120pLAFR-1 con un fragmento EcoRI de 4.4 kb que contienegreA, lpcC, dctA y la región 5'de dctB de R. leguminosarum bv. viciae, TcrRefs. 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar and7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Tabla abierta de Google Scholar en una nueva pestaña Se prepararon plásmidos utilizando el kit Qiagen Mini Prep (Qiagen). Se utilizaron endonucleasas de restricción, polimerasa Pfu (Stratagene), fosfatasa alcalina de camarón y ligasa T4 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células competentes de E. coli se prepararon para la transformación utilizando el método del cloruro de calcio (11Bergmans H.E. van Die I.M. Hoekstra W.P. J. Bacteriol. 1981; 146: 564-570Crossref PubMed Google Scholar,12Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). La introducción de plásmidos en S. meliloti se llevó a cabo mediante conjugación como se describió anteriormente (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Los cebadores de PCR se diseñaron para recuperar el gen lpsB de S. meliloti del plásmido pAL100 (Tabla I) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) e introducir sitios de restricción NdeI y BamHI en los extremos del producto de PCR, como se indica. Los cebadores utilizados para obtener lpsB tienen las siguientes secuencias: directo, 5′-GAATTCCATATGGTCGATATCCGCGACGTC-3′; inverso, 5′-GAATTCGGATCCTCAACGCATCAGGCTTTCGTAAAC-3′. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 45 s de desnaturalización a 98 °C y luego 25 ciclos de desnaturalización (45 s, 98 °C), hibridación (45 s, 55 °C) y extensión (1,5 min, 72 °C). Después del último ciclo, se realizó una extensión adicional de 10 minutos a 72 °C. El producto de ADN de 1056 pares de bases resultante se digirió con las enzimas de restricción NdeI y BamHI y se ligó en un vector de expresión, pET28b, que se había digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar E. coli XL1 Blue, seleccionando la resistencia a la kanamicina (30 μg/ml). La presencia de los insertos adecuados en plásmidos de varias colonias se verificó mediante mapeo de restricción. La construcción deseada, designada pMKRM, se transfirió luego a E. coli BLR(DE3)/pLysS para la expresión heteróloga de alto nivel de lpsB. Cada cepa de S. meliloti mostrada en la Tabla I se cultivó a partir de una sola colonia en 1 litro de medio TY que contenía los antibióticos apropiados hasta una densidad óptica de 600 = 1,4 (fase logarítmica tardía). Se cultivó E. coli BLR(DE3)/pLysS/pMKRM a partir de una sola colonia en 1 litro de medio LB que contenía 30 μg/ml de cloranfenicol y 30 μg/ml de kanamicina a 37 °C hasta que el A 600 alcanzó ~0,5. El cultivo se indujo con 1 mmisopropil-1-tio-β-d-galactopiranósido y se incubó con agitación durante 3 h adicionales a 30 °C. Las células de los cultivos de 1 litro anteriores se cosecharon a 4 °C mediante centrifugación a 4.000 × g durante 10 min, se resuspendieron cada una en 30 ml de HEPES 50 mm, pH 7,5, y se rompieron mediante un pase a través de una celda de presión francesa a 18.000 psi. Los desechos y los cuerpos de inclusión se retiraron mediante centrifugación a 4.000 × g durante 15 min. Las membranas se prepararon mediante ultracentrifugación a 100.000 × g durante 60 min. Las membranas se resuspendieron en 20 ml del mismo amortiguador, y la centrifugación se repitió una segunda vez a 100.000 ×g para eliminar cualquier citosol restante. La concentración de proteína se determinó mediante el método bicinconínico (13Smith P.K. Krohn R.I. Hermanson G.T. Mallia A.K. Gartner F.H. Provenzano M.D. Fujimoto E.K. Goeke N.M. Olson B.J. Klenk D.C. Anal. Biochem. 1985; 150: 76-85 Crossref PubMed Scopus (19132) Google Scholar) (Pierce). El sedimento de membrana se resuspendió a 10–15 mg de proteína/ml en 50 mmHEPES, pH 7.5, y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. Las manosil transferasas LpcC y LpsB se analizaron utilizando el precursor de lipopolisacáridoKdo2- [4′-32P]lípido IVA, que se sintetizó, aisló y almacenó como una dispersión acuosa congelada, como se describió anteriormente (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11139-11149Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar). Antes de cada uso, el sustrato radiomarcado se sometió a irradiación ultrasónica en un baño de agua durante 1 min. La manosil transferasa se analizó de la siguiente manera. La mezcla de reacción (volumen final de 10 μl) contenía HEPES de 50 mm, pH 7,5, Triton X-100 al 0,1%, GDP-manosa de 1 mm y Kdo2- [4′-32P]lípido IVA de 10 μm (3000–6000 cpm/nmol). La reacción se inició mediante la adición de una cantidad adecuada de enzima (generalmente a una concentración final de 1,0 mg/ml de membranas de S. meliloti o 0,02 mg/ml de membranas lavadas de células de E. coli que sobreexpresan lpsB detrás del promotor T7lac) y se incubaron durante los tiempos indicados a 30 °C. Las reacciones se detuvieron colocando muestras de 4 μl directamente sobre una placa de capa delgada de gel de sílice. Después de secar las manchas a temperatura ambiente, la placa se desarrolló en el disolvente cloroformo, piridina, ácido fórmico al 88%, agua (30:70:16:10, v/v/v/v). Después de la eliminación del disolvente con una corriente de aire caliente, la placa se analizó utilizando un Amersham Biosciences PhosphorImager (Storm 840), equipado con el software ImageQuant. Otras actividades de glicosil transferasa de LpsB se analizaron de la misma manera, pero en presencia de los nucleótidos de azúcar alternativos indicados presentes a 1 mm. Se extrajo LPS (es decir, Kdo2-lípido A) de un cultivo de 100 ml de células de fase logarítmica tardía (OD = 1.4) con una mezcla de Bligh-Dyer de fase única, que consiste en cloroformo/metanol/agua (1:2:0.8, v/v/v). Después del reparto de fases, el LPS se purificó mediante cromatografía en una columna de DEAE-celulosa, preparada en cloroformo/metanol/agua (2:3:1, v/v/v) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Los espectros se adquirieron en el modo negativo utilizando un espectrómetro de masas Kompact 4 de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) (Kratos Analytical, Manchester, Reino Unido), equipado con un láser de nitrógeno de 337 nm y ajustado a un voltaje de extracción de 20 kV. Las condiciones fueron las mismas que se describen en el documento anterior (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Como se muestra en la Fig. 2A (carril 5), las membranas de R. leguminosarum 3841 (15Poole P.S. Schofield N.A. Reid C.J. Drew E.M. Walshaw D.L. Microbiology. 1994; 140: 2797-2809 Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar) glucosilanKdo2- [4′-32P]lípido IVA de una manera altamente selectiva utilizando GDP-manosa como sustrato donante preferido. El análogo no fisiológico ADP-manosa, un producto natural que se encuentra en el maíz (16Dankert M. Passeron S. Recondo E. Leloir L.F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1964; 14: 358-362Crossref PubMed Scopus (10) Google Scholar, 17Passeron S. Recondo E. Dankert M. Biochim. Biophys. Acta. 1964; 89: 372-374PubMed Google Scholar), puede sustituir a GDP-manosa (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32119-32125Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar), aunque no tan eficazmente (Fig. 2 A,carril 4). No se pueden incorporar otros azúcares centrales antes de la adición del primer residuo de manosa al Kdo2-lípido IVA (datos no mostrados) (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar, 19Brozek K.A. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32112-32118Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (41) Google Scholar). La actividad manosil transferasa de R. leguminosarumis catalizada por LpcC, que muestra muy poca actividad transferasa con otros donantes de nucleótidos de azúcar, como ADP-glucosa o UDP-glucosa (Fig. 2 A, carriles 3 y 9, respectivamente) (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar, 4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). En estudios anteriores con S. meliloti 1021 (18Kadrmas J.L. Brozek K.A. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32119-32125Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (34) Google Scholar), se detectó poca o ninguna actividad manosil transferasa en extractos celulares o membranas preparadas a partir de células cultivadas en medio TY. Por lo tanto, se utilizaron células S. meliloti 1021 para la clonación de expresión y caracterización de lpcC de R. leguminosarum (4Kadrmas J.L. Allaway D. Studholme R.E. Sullivan J.T. Ronson C.W. Poole P.S. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26432-26440Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (40) Google Scholar). Sin embargo, cuando se cultivan de una manera más controlada hasta la fase logarítmica tardía, como se describió anteriormente, las membranas de S. meliloti 1021 catalizan de hecho la manosilación rápida de Kdo2-[4′-32P]lípido IVA (Fig. 2 B, carriles 12 y 13). Curiosamente, se observan otras glicosilaciones de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA con membranas de S. meliloti 1021 (Fig.2 B), que están ausentes en R. leguminosarum 3841 (Fig. 2 A), a juzgar por el cambio de la banda de sustrato radiactivo a especies que migran más lentamente con ADP-glucosa, UDP-galactosa y UDP-glucosa (Fig. 2 B, carriles 11, 14 y 17, respectivamente). Incluso existe la formación de algunos productos de glicosilación secundaria de Kdo2-[4′-32P]lípido IVA con ADP-glucosa, UDP-galactosa y UDP-glucosa (Fig. 2 B,carriles 11, 14 y 17), que no se observan cuando se emplean ADP-manosa o GDP-manosa como sustratos donantes (Fig. 2 B, carriles 12 y 13). En condiciones coincidentes, ADP-glucosa, UDP-galactosa y UDP-glucosa no soportan ninguna glicosilación de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA en membranas de R. leguminosarum 3841 (Fig.2 A) o R. etli CE3 (datos no mostrados). Ni las membranas de R. leguminosarum ni S. meliloti 1021 catalizan la glicosilación eficiente de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA con UDP-GalUA o UDP-GlcNAc como donantes de azúcar (Fig. 2, A(carriles 7 y 8) y B(carriles 15 y 16)). La formación de fosfato inorgánico por las membranas de R. leguminosarum se atribuye a la actividad 4′-fosfatasa, que está ausente en S. meliloti (Fig. 2, A versus B) (14Basu S.S. York J.D. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11139-11149Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar, 20Price N.J.P. Jeyaretnam B. Carlson R.W. Kadrmas J.L. Raetz C.R.H. Brozek K.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 7352-7356Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar). El genoma completo de S. meliloti 1021 (6Galibert F. Finan T.M. Long S.R. Puhler A. Abola P. Ampe F. Barloy-Hubler F. Barnett M.J. Becker A. Boistard P. Bothe G. Boutry M. Bowser L. Buhrmester J. Cadieu E. Capela D. Chain P. Cowie A. Davis R.W. Dreano S. Federspiel N.A. Fisher R.F. Gloux S. Godrie T. Goffeau A. Golding B. Gouzy J. Gurjal M. Hernandez-Lucas I. Hong A. Huizar L. Hyman R.W. Jones T. Kahn D. Kahn M.L. Kalman S. Keating D.H. Kiss E. Komp C. Lelaure V. Masuy D. Palm C. Peck M.C. Pohl T.M. Portetelle D. Purnelle B. Ramsperger U. Surzycki R. Thebault P. Vandenbol M. Vorholter F.J. Weidner S. Wells D.H. Wong K. Yeh K.C. Batut J. Science. 2001; 293: 668-672 Crossref PubMed Scopus (951) Google Scholar) e intrigantes estudios recientes del S. meliloti isogénico 2011 (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) han revelado la presencia de un ortólogo significativo de LpcC (58% de identidad y 72% de similitud en toda la longitud de la proteína) en ambas cepas bacterianas (Fig. 1). En el caso de la cepa S. meliloti 2011, este ortólogo de LpcC (que se denominó LpsB) (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar) se requiere tanto para el ensamblaje de oligosacáridos centrales como para la simbiosis conMedicago spp., a juzgar por el análisis del mutante 6963, que contiene una inserción de Tn5 en lpsB. Por lo tanto, decidimos examinar la glicosilación deKdo2- [4′-32P]lípido IVA utilizando membranas de S. meliloti 2011 y mutante 6963. Cuando las membranas de S. meliloti 2011 se analizan a 1 mg/ml para determinar su capacidad para glicosilar Kdo2-[4′-32P]lípido IVA, se observa esencialmente el mismo patrón complejo de adiciones de azúcar (Fig. 3) que con las membranas de S. meliloti 1021 (Fig. 2 B). Cuando se analizan membranas lavadas comparables del mutante 6963 de S. meliloti, no se observa glicosilación de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA de ningún tipo (datos no mostrados). Este sorprendente resultado sugiere que las diversas glicosilaciones observadas en las Figuras 2 B y 3 son todas el resultado de una sola enzima con selectividad de sustrato de nucleótido de azúcar relajado, en contraste con LpcC. Sin embargo, basándose solo en este hallazgo, no se puede excluir algún tipo de efecto regulador pleiotrópico secundario a la inserción de Tn5 en el gen lpsB del mutante 6963. Hemos descrito previamente los plásmidos pJBlpsSme, que contiene lpsB en un fragmento de 4,9 kb de ADN de S. meliloti 2011, y pPN120, que alberga lpcC en un fragmento de 4,4 kb de ADN de R. leguminosarum (7Lagares A. Hozbor D.F. Niehaus K. Otero A.J. Lorenzen J. Arnold W. Puhler A.J. Bacteriol. 2001; 183: 1248-1258 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Como se muestra en la Fig. 4, la introducción de cualquiera de estos plásmidos en el mutante 6963 (carriles 4 y 5) restaura la actividad completa de manosil transferasa, según lo juzgado por el ensayo de membranas celulares con Kdo2- [4′-32P]lípido IVA en presencia de GDP-manosa. De hecho, todas las otras glicosilaciones de Kdo2- [4′-32P]lípido IVA también se restauran al mutante 6963 mediante el plásmido pJBlpsSme (Fig. 5). Por el contrario, cuando las membranas de las células mutantes 6963 que albergan el plásmido pPN120 que contiene lpcC se analizan con los otros donantes de nucleótidos de azúcar (Fig.6), no se observa actividad con ADP-glucosa, UDP-galactosa o UDP-glucosa, consistente con la especificidad de sustrato de las membranas de R. leguminosarum nativas (Fig.2 A) y de LpcC purificada (1Kanipes M.I. Ribeiro A.A. Lin S. Cotter R.J. Raetz C.R.H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 16356-16364Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (14) Google Scholar). Estos resultados (Fig. 6) excluyen la posibilidad de que enzimas adicionales presentes en extractos brutos de S. meliloti 2011 estén interconvirtiendo todos los diversos nucleótidos de azúcar añadidos al sistema de ensayo para dar cuenta de las diversas glicosilaciones observadas en las Figs. 2 B, 3 y 5.Figura 5Restauración de otras reacciones de glucosilación de IVA de Kdo2-lípido en membranas de lpsBmutante 6963 que expresa S. meliloti lpsB. Las reacciones se llevaron a cabo en condiciones estándar a pH 7.5 usando una concentración de 1 mm de cada uno de los nucleótidos de azúcar, como se indica. Las membranas se utilizaron a 1 mg/ml. La incubación se llevó a cabo a 30 °C durante 60 min. Ver Figura de imagen grande VisorDescargar imagen de alta resolución Descargar (PPT)Figura 6No Kdo2-lípido IVAglicosilación con azúcares distintos de manosa en membranas de lpsB mutante 6963 que expresa R. leguminosarum lpcC. Las reacciones se llevaron a cabo en condiciones estándar a pH 7.5 usando una concentración de 1 mm de cada uno de los nucleótidos de azúcar, como se indica. Las membranas se utilizaron como fuente de enzima a 1 mg/ml. La incubación se llevó a cabo a 30 °C durante 60 min. Ver imagen grande Visor de figuras Descargar imagen de alta resolución (PPT) El gen lpsB de S. meliloti 2011 se clonó detrás del promotor T7lac del plásmido de expresión pET28b para generar pMKRM y se transformó en E. colistrain BLR(DE3)/pLysS. Las membranas lavadas se analizaron a partir de células que se habían inducido en fase logarítmica tardía con isopropil-1-tio-β-d-galactopiranósido durante 3 h. Como se muestra en la Fig. 7 A(panel superior), las membranas de las células que albergan el control del vector (a 0.02 mg/ml) catalizan poca o ninguna glicosilación deKdo2- [4′-32P]lípido IVA, con

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انتقائية مانح السكر المريح لمقوام سينوريزوبيوم ميليلوتي من Rhizobium leguminosarumMannosyl Transferase Lpc
Translated title (French)
Sélectivité du donneur de sucre détendu d'un orthologue de Sinorhizobium meliloti du Rhizobium leguminosarumMannosyl transférase LpcC
Translated title (Spanish)
Selectividad relajada del donante de azúcar de un ortólogo de Sinorhizobium meliloti de Rhizobium leguminosarumMannosyl Transferase LpcC

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DOI
10.1074/jbc.m301256200

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https://openalex.org/W2788277189 (Other)
https://openalex.org/W2130076355 (Other)
https://openalex.org/W2119695867 (Other)
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