Published May 15, 2024
| Version v1
Publication
Open
Heterologous expression and characterization of mutant cellulase from indigenous strain of Aspergillus niger
Description
The purpose of current research work was to investigate the effect of mutagenesis on endoglucanase B activity of indigenous strain of Aspergillus niger and its heterologous expression studies in the pET28a+ vector. The physical and chemical mutagens were employed to incorporate mutations in A . niger . For determination of mutations, mRNA was isolated followed by cDNA synthesis and cellulase gene was amplified, purified and sequenced both from native and mutant A . niger . On comparison of gene sequences, it was observed that 5 nucleotide base pairs have been replaced in the mutant cellulase. The mutant recombinant enzyme showed 4.5 times higher activity (428.5 µmol/mL/min) as compared to activity of native enzyme (94 µmol/mL/min). The mutant gene was further investigated using Phyre2 and I-Tesser tools which exhibited 71% structural homology with Endoglucanase B of Thermoascus aurantiacus . The root mean square deviation (RMSD), root mean square fluctuation (RMSF), solvent accessible surface area (SASA), radius of gyration (Rg) and hydrogen bonds analysis were carried at 35°C and 50°C to explore the integrity of structure of recombinant mutant endoglucanase B which corresponded to its optimal temperature. Hydrogen bonds analysis showed more stability of recombinant mutant endoglucanase B as compared to native enzyme. Both native and mutant endoglucanase B genes were expressed in pET 28a+ and purified with nickel affinity chromatography. Theoretical masses determined through ExPaSy Protparam were found 38.7 and 38.5 kDa for native and mutant enzymes, respectively. The optimal pH and temperature values for the mutant were 5.0 and 50°C while for native these were found 4.0 and 35°C, respectively. On reacting with carboxy methyl cellulose (CMC) as substrate, the mutant enzyme exhibited less K m (0.452 mg/mL) and more V max (50.25 µmol/ml/min) as compared to native having 0.534 mg/mL as K m and 38.76 µmol/ml/min as V max . Among metal ions, Mg 2+ showed maximum inducing effect (200%) on cellulase activity at 50 mM concentration followed by Ca 2+ (140%) at 100 mM concentration. Hence, expression of a recombinant mutant cellulase from A . niger significantly enhanced its cellulytic potential which could be employed for further industrial applications at pilot scale.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
كان الغرض من العمل البحثي الحالي هو التحقيق في تأثير الطفرات على نشاط إندوغلوكاناز ب لسلالة السكان الأصليين من الرشاشيات السوداء ودراسات التعبير غير المتجانسة في ناقلPET28a +. تم استخدام الطفرات الفيزيائية والكيميائية لدمج الطفرات في A . niger . لتحديد الطفرات، تم عزل mRNA متبوعًا بتخليق cDNA وتم تضخيم جين السليولاز وتنقيته وتسلسله من كل من الأصل والطفرة A . niger . عند مقارنة تسلسلات الجينات، لوحظ أنه تم استبدال 5 أزواج من قاعدة النيوكليوتيدات في السليولاز المتحور. أظهر الإنزيم المتحور المؤتلف نشاطًا أعلى 4.5 مرات (428.5 ميكرومول/مل/دقيقة) مقارنة بنشاط الإنزيم الأصلي (94 ميكرومول/مل/دقيقة). تم التحقيق في الجين الطافر باستخدام أدوات Phyre2 و I - Tesser التي أظهرت 71 ٪ من التماثل الهيكلي مع Endoglucanase B من Thermoascus aurantiacus . تم إجراء تحليل لمتوسط انحراف الجذر التربيعي (RMSD)، ومتوسط تذبذب الجذر التربيعي (RMSF)، ومساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بالمذيب (SASA)، ونصف قطر الدوران (Rg)، والروابط الهيدروجينية عند 35 درجة مئوية و 50 درجة مئوية لاستكشاف سلامة بنية إندوغلوكاناز الطافرة المؤتلفة B التي تتوافق مع درجة حرارتها المثلى. أظهر تحليل الروابط الهيدروجينية المزيد من الاستقرار في إندوغلوكاناز B المتحور المؤتلف مقارنة بالإنزيم الأصلي. تم التعبير عن كل من جينات endoglucanase B الأصلية والمتحولة في PET28A + وتنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا تقارب النيكل. تم العثور على الكتل النظرية المحددة من خلال ExPaSy Protparam 38.7 و 38.5 كيلو دالتون للإنزيمات الأصلية والمتحولة، على التوالي. كانت قيم الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة المثلى للطفرة هي 5.0 و 50 درجة مئوية بينما تم العثور على 4.0 و 35 درجة مئوية بالنسبة للسكان الأصليين، على التوالي. عند التفاعل مع كربوكسي ميثيل السليلوز (CMC) كركيزة، أظهر الإنزيم الطافر أقل من Km (0.452 مجم/مل) وأكثر من V max (50.25 ميكرومول/مل/دقيقة) مقارنةً بالمواد الأصلية التي تحتوي على 0.534 مجم/مل في Km و 38.76 ميكرومول/مل/دقيقة في V max . من بين أيونات المعادن، أظهر المغنيسيوم 2+ أقصى تأثير حث (200 ٪) على نشاط السليولاز عند تركيز 50 مللي مولار يليه الكالسيوم 2+ (140 ٪) عند تركيز 100 مللي مولار. وبالتالي، فإن التعبير عن السليلوز المتحور المؤتلف من A . niger عزز بشكل كبير من إمكاناته الخلوية التي يمكن استخدامها لمزيد من التطبيقات الصناعية على نطاق تجريبي.Translated Description (French)
Le but des travaux de recherche actuels était d'étudier l'effet de la mutagenèse sur l'activité de l'endoglucanase B de la souche indigène d'Aspergillus niger et ses études d'expression hétérologue dans le vecteur pET28a+. Les mutagènes physiques et chimiques ont été utilisés pour incorporer des mutations chez A. niger . Pour la détermination des mutations, l'ARNm a été isolé suivi de la synthèse de l'ADNc et le gène de la cellulase a été amplifié, purifié et séquencé à la fois à partir du natif et du mutant A. niger . En comparant les séquences géniques, il a été observé que 5 paires de bases nucléotidiques ont été remplacées dans la cellulase mutante. L'enzyme recombinante mutante a montré une activité 4,5 fois plus élevée (428,5 µmol/mL/min) par rapport à l'activité de l'enzyme native (94 µmol/mL/min). Le gène mutant a été étudié plus en détail à l'aide d'outils Phyre2 et I-Tesser qui présentaient une homologie structurelle de 71 % avec l'endoglucanase B de Thermoascus aurantiacus . L'analyse de la déviation quadratique moyenne (RMSD), de la fluctuation quadratique moyenne (RMSF), de la surface accessible aux solvants (SASA), du rayon de giration (Rg) et des liaisons hydrogène a été réalisée à 35°C et 50°C pour explorer l'intégrité de la structure de l'endoglucanase B mutante recombinante qui correspondait à sa température optimale. L'analyse des liaisons hydrogène a montré une plus grande stabilité de l'endoglucanase B mutante recombinante par rapport à l'enzyme native. Les gènes endoglucanase B natifs et mutants ont été exprimés dans le pET 28a+ et purifiés par chromatographie d'affinité sur nickel. Les masses théoriques déterminées par ExPaSy Protparam ont été trouvées à 38,7 et 38,5 kDa pour les enzymes natives et mutantes, respectivement. Les valeurs optimales de pH et de température pour le mutant étaient de 5,0 et 50 °C, tandis que pour les natifs, elles étaient de 4,0 et 35 °C, respectivement. En réagissant avec la carboxyméthylcellulose (CMC) comme substrat, l'enzyme mutante présentait moins de K m (0,452 mg/ml) et plus de V max (50,25 µmol/ml/min) par rapport à une enzyme native ayant 0,534 mg/ml comme K m et 38,76 µmol/ml/min comme V max . Parmi les ions métalliques, le Mg 2+ a montré un effet inducteur maximal (200 %) sur l'activité de la cellulase à une concentration de 50 mM, suivi du Ca 2+ (140 %) à une concentration de 100 mM. Par conséquent, l'expression d'une cellulase mutante recombinante de A. niger a considérablement amélioré son potentiel cellulytique qui pourrait être utilisé pour d'autres applications industrielles à l'échelle pilote.Translated Description (Spanish)
El propósito del trabajo de investigación actual fue investigar el efecto de la mutagénesis sobre la actividad endoglucanasa B de la cepa indígena de Aspergillus niger y sus estudios de expresión heteróloga en el vector pET28a+. Los mutágenos físicos y químicos se emplearon para incorporar mutaciones en A. niger . Para la determinación de mutaciones, se aisló ARNm seguido de síntesis de ADNc y se amplificó, purificó y secuenció el gen de celulasa tanto de A. niger nativo como mutante. Al comparar las secuencias génicas, se observó que se han reemplazado 5 pares de bases de nucleótidos en la celulasa mutante. La enzima recombinante mutante mostró una actividad 4.5 veces mayor (428.5 µmol/mL/min) en comparación con la actividad de la enzima nativa (94 µmol/mL/min). El gen mutante se investigó adicionalmente utilizando herramientas Phyre2 e I-Tesser que exhibieron 71% de homología estructural con Endoglucanasa B de Thermoascus aurantiacus . La desviación cuadrática media (RMSD), la fluctuación cuadrática media (RMSF), el área de superficie accesible al disolvente (SASA), el radio de giro (Rg) y el análisis de enlaces de hidrógeno se realizaron a 35 °C y 50 °C para explorar la integridad de la estructura de la endoglucanasa B mutante recombinante que correspondía a su temperatura óptima. El análisis de enlaces de hidrógeno mostró más estabilidad de la endoglucanasa B mutante recombinante en comparación con la enzima natural. Los genes de endoglucanasa B tanto nativos como mutantes se expresaron en pET 28a+ y se purificaron con cromatografía de afinidad de níquel. Las masas teóricas determinadas a través de ExPaSy Protparam se encontraron 38.7 y 38.5 kDa para enzimas nativas y mutantes, respectivamente. Los valores óptimos de pH y temperatura para el mutante fueron 5,0 y 50 °C, mientras que para el nativo se encontraron 4,0 y 35 °C, respectivamente. Al reaccionar con carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato, la enzima mutante mostró menos K m (0,452 mg/ml) y más V máx (50,25 µmol/ml/min) en comparación con la nativa que tenía 0,534 mg/ml como K m y 38,76 µmol/ml/min como V máx . Entre los iones metálicos, Mg 2+ mostró un efecto inductor máximo (200%) sobre la actividad de la celulasa a una concentración de 50 mM, seguido de Ca 2+ (140%) a una concentración de 100 mM. Por lo tanto, la expresión de una celulasa mutante recombinante de A. niger mejoró significativamente su potencial celulítico que podría emplearse para otras aplicaciones industriales a escala piloto.Files
journal.pone.0298716&type=printable.pdf
Files
(3.3 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:fd3c9b929c66ed9b6061711c7ae4ee44
|
3.3 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تعبير غير متجانس وتوصيف السليلوز المتحور من سلالة أصلية من الرشاشيات السوداء
- Translated title (French)
- Expression hétérologue et caractérisation de la cellulase mutante à partir de la souche indigène d'Aspergillus niger
- Translated title (Spanish)
- Expresión heteróloga y caracterización de celulasa mutante de cepa autóctona de Aspergillus niger
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W4396939075
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0298716
References
- https://openalex.org/W1019448416
- https://openalex.org/W1988497640
- https://openalex.org/W1990554387
- https://openalex.org/W2019430378
- https://openalex.org/W2029859602
- https://openalex.org/W2057290242
- https://openalex.org/W2064902795
- https://openalex.org/W2087101537
- https://openalex.org/W2099323499
- https://openalex.org/W2106935782
- https://openalex.org/W2109006822
- https://openalex.org/W2132666111
- https://openalex.org/W2135040897
- https://openalex.org/W2227165318
- https://openalex.org/W2528045957
- https://openalex.org/W2555870966
- https://openalex.org/W2583697225
- https://openalex.org/W2738887068
- https://openalex.org/W2755801050
- https://openalex.org/W2763710148
- https://openalex.org/W2786846446
- https://openalex.org/W2905591063
- https://openalex.org/W3095537528
- https://openalex.org/W3111960472
- https://openalex.org/W3131398565
- https://openalex.org/W4205146277
- https://openalex.org/W4206274219
- https://openalex.org/W4212867972
- https://openalex.org/W4309650668
- https://openalex.org/W4392166065