Published January 21, 2008
| Version v1
Publication
Open
The effects of the surface-exposed residues on the binding and hydrolytic activities of Vibrio carchariae chitinase A
- 1. Suranaree University of Technology
- 2. Synchrotron Light Research Institute
Description
Vibrio carchariae chitinase A (EC3.2.1.14) is a family-18 glycosyl hydrolase and comprises three distinct structural domains: i) the amino terminal chitin binding domain (ChBD); ii) the (alpha/beta)8 TIM barrel catalytic domain (CatD); and iii) the alpha + beta insertion domain. The predicted tertiary structure of V. carchariae chitinase A has located the residues Ser33 & Trp70 at the end of ChBD and Trp231 & Tyr245 at the exterior of the catalytic cleft. These residues are surface-exposed and presumably play an important role in chitin hydrolysis.Point mutations of the target residues of V. carchariae chitinase A were generated by site-directed mutagenesis. With respect to their binding activity towards crystalline alpha-chitin and colloidal chitin, chitin binding assays demonstrated a considerable decrease for mutants W70A and Y245W, and a notable increase for S33W and W231A. When the specific hydrolyzing activity was determined, mutant W231A displayed reduced hydrolytic activity, whilst Y245W showed enhanced activity. This suggested that an alteration in the hydrolytic activity was not correlated with a change in the ability of the enzyme to bind to chitin polymer. A mutation of Trp70 to Ala caused the most severe loss in both the binding and hydrolytic activities, which suggested that it is essential for crystalline chitin binding and hydrolysis. Mutations varied neither the specific hydrolyzing activity against pNP-[GlcNAc]2, nor the catalytic efficiency against chitohexaose, implying that the mutated residues are not important in oligosaccharide hydrolysis.Our data provide direct evidence that the binding as well as hydrolytic activities of V. carchariae chitinase A to insoluble chitin are greatly influenced by Trp70 and less influenced by Ser33. Though Trp231 and Tyr245 are involved in chitin hydrolysis, they do not play a major role in the binding process of crystalline chitin and the guidance of the chitin chain into the substrate binding cleft of the enzyme.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
Vibrio carchariae chitinase A (EC3.2.1.14) عبارة عن هيدرولاز جليكوزيل من عائلة 18 ويتألف من ثلاثة مجالات هيكلية متميزة: 1) مجال ربط الكيتين الطرفي الأميني (ChBD )؛ 2) المجال الحفاز للبرميل (ألفا/بيتا) 8 TIM (CatD )؛ و 3) مجال إدخال ألفا + بيتا. حدد الهيكل الثالث المتوقع لـ V. carchariae chitinase A البقايا Ser33 & Trp70 في نهاية ChBD و Trp231 & Tyr245 في الجزء الخارجي من الشق الحفاز. هذه البقايا معرضة للسطح ومن المفترض أن تلعب دورًا مهمًا في التحلل المائي للكيتين. تم توليد الطفرات النقطية للبقايا المستهدفة من V. carchariae chitinase A بواسطة الطفرات الموجهة للموقع. فيما يتعلق بنشاط ربطها تجاه ألفا الكيتين البلوري والكيتين الغرواني، أظهرت فحوصات ربط الكيتين انخفاضًا كبيرًا للطفرات W70A و Y245W، وزيادة ملحوظة في S33W و W231A. عندما تم تحديد نشاط التحلل المائي المحدد، أظهرت الطفرة W231A انخفاضًا في نشاط التحلل المائي، بينما أظهر Y245W نشاطًا محسنًا. وهذا يشير إلى أن التغيير في النشاط التحليلي المائي لم يكن مرتبطًا بتغير في قدرة الإنزيم على الارتباط ببوليمر الكيتين. تسببت طفرة في Trp70 إلى ALA في أكبر خسارة في كل من أنشطة الربط والتحلل المائي، مما يشير إلى أنها ضرورية لربط الكيتين البلوري والتحلل المائي. لم تختلف الطفرات في نشاط التحلل المائي المحدد ضد pNP - [GlcNAc]2، ولا في الكفاءة التحفيزية ضد الكيتوهيكساوز، مما يعني أن البقايا المتحولة ليست مهمة في التحلل المائي للأوليغوساكاريد. توفر بياناتنا دليلًا مباشرًا على أن أنشطة الارتباط وكذلك التحلل المائي لـ V. carchariae chitinase A إلى الكيتين غير القابل للذوبان تتأثر بشكل كبير بـ Trp70 وأقل تأثرًا بـ Ser33. على الرغم من أن Trp231 و Tyr245 يشاركان في التحلل المائي للكيتين، إلا أنهما لا يلعبان دورًا رئيسيًا في عملية ربط الكيتين البلوري وتوجيه سلسلة الكيتين في الشق الرابط للركيزة من الإنزيم.Translated Description (French)
La chitinase A de Vibrio carchariae (EC3.2.1.14) est une glycosyl hydrolase de la famille 18 et comprend trois domaines structuraux distincts : i) le domaine de liaison à la chitine amino terminal (ChBD) ; ii) le domaine catalytique (alpha/bêta)8 TIM barrel (CatD) ; et iii) le domaine d'insertion alpha + bêta. La structure tertiaire prédite de la chitinase A de V. carchariae a localisé les résidus Ser33 & Trp70 à l'extrémité de ChBD et Trp231 & Tyr245 à l'extérieur de la fente catalytique. Ces résidus sont exposés en surface et jouent probablement un rôle important dans l'hydrolyse de la chitine. Des mutations ponctuelles des résidus cibles de la chitinase A de V. carchariae ont été générées par mutagenèse dirigée. En ce qui concerne leur activité de liaison à l'alpha-chitine cristalline et à la chitine colloïdale, les tests de liaison à la chitine ont démontré une diminution considérable pour les mutants W70A et Y245W, et une augmentation notable pour S33W et W231A. Lorsque l'activité hydrolysante spécifique a été déterminée, le mutant W231A a montré une activité hydrolytique réduite, tandis que Y245W a montré une activité accrue. Cela suggère qu'une altération de l'activité hydrolytique n'était pas corrélée à un changement dans la capacité de l'enzyme à se lier au polymère de chitine. Une mutation de Trp70 en ALA a causé la perte la plus grave à la fois dans les activités de liaison et d'hydrolyse, ce qui suggère qu'elle est essentielle pour la liaison et l'hydrolyse de la chitine cristalline. Les mutations ne variaient ni l'activité hydrolysante spécifique contre pNP-[GlcNAc]2, ni l'efficacité catalytique contre le chitohexaose, ce qui implique que les résidus mutés ne sont pas importants dans l'hydrolyse des oligosaccharides. Nos données fournissent des preuves directes que la liaison ainsi que les activités hydrolytiques de la chitinase A de V. carchariae à la chitine insoluble sont fortement influencées par Trp70 et moins influencées par Ser33. Bien que Trp231 et Tyr245 soient impliqués dans l'hydrolyse de la chitine, ils ne jouent pas un rôle majeur dans le processus de liaison de la chitine cristalline et le guidage de la chaîne de chitine dans la fente de liaison au substrat de l'enzyme.Translated Description (Spanish)
La quitinasa A de Vibrio carchariae (EC3.2.1.14) es una glicosil hidrolasa de la familia 18 y comprende tres dominios estructurales distintos: i) el dominio de unión a quitina amino terminal (ChBD); ii) el dominio catalítico de barril (alfa/beta)8 TIM (CatD); y iii) el dominio de inserción alfa + beta. La estructura terciaria predicha de quitinasa A de V. carchariae ha localizado los residuos Ser33 y Trp70 al final de ChBD y Trp231 y Tyr245 en el exterior de la hendidura catalítica. Estos residuos están expuestos en la superficie y presumiblemente desempeñan un papel importante en la hidrólisis de la quitina. Las mutaciones puntuales de los residuos diana de la quitinasa A de V. carchariae se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio. Con respecto a su actividad de unión hacia la alfa-quitina cristalina y la quitina coloidal, los ensayos de unión a quitina demostraron una disminución considerable para los mutantes W70A e Y245W, y un aumento notable para S33W y W231A. Cuando se determinó la actividad hidrolizante específica, el mutante W231A mostró una actividad hidrolítica reducida, mientras que Y245W mostró una actividad mejorada. Esto sugirió que una alteración en la actividad hidrolítica no se correlacionó con un cambio en la capacidad de la enzima para unirse al polímero de quitina. Una mutación de Trp70 a ala causó la pérdida más severa en las actividades de unión e hidrolítica, lo que sugirió que es esencial para la unión e hidrólisis de quitina cristalina. Las mutaciones no variaron ni la actividad hidrolizante específica contra pNP- [GlcNAc]2, ni la eficiencia catalítica contra la quitohexaosa, lo que implica que los residuos mutados no son importantes en la hidrólisis de oligosacáridos. Nuestros datos proporcionan evidencia directa de que la unión, así como las actividades hidrolíticas de la quitinasa A de V. carchariae a la quitina insoluble están muy influenciadas por Trp70 y menos influenciadas por Ser33. Aunque Trp231 y Tyr245 están involucrados en la hidrólisis de quitina, no juegan un papel importante en el proceso de unión de la quitina cristalina y la guía de la cadena de quitina en la hendidura de unión al sustrato de la enzima.Files
1471-2091-9-2.pdf
Files
(1.8 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:61a08a3623cd18462ecf68c8936bca55
|
1.8 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- آثار المخلفات المعرضة للسطح على أنشطة الربط والتحلل المائي للضمة carchariae chitinase A
- Translated title (French)
- Les effets des résidus exposés en surface sur les activités liantes et hydrolytiques de la chitinase A de Vibrio carchariae
- Translated title (Spanish)
- Los efectos de los residuos expuestos en la superficie sobre las actividades de unión e hidrolíticas de la quitinasa A de Vibrio carchariae
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2046526676
- DOI
- 10.1186/1471-2091-9-2
References
- https://openalex.org/W1543194508
- https://openalex.org/W1546730880
- https://openalex.org/W1547610396
- https://openalex.org/W1673140692
- https://openalex.org/W1822985763
- https://openalex.org/W1969133950
- https://openalex.org/W1969215536
- https://openalex.org/W1975833627
- https://openalex.org/W1978108133
- https://openalex.org/W1988479656
- https://openalex.org/W1989449470
- https://openalex.org/W2001210755
- https://openalex.org/W2006482151
- https://openalex.org/W2010869624
- https://openalex.org/W2014936174
- https://openalex.org/W2015814027
- https://openalex.org/W2060797818
- https://openalex.org/W2061225874
- https://openalex.org/W2080934006
- https://openalex.org/W2087082796
- https://openalex.org/W2100837269
- https://openalex.org/W2105738898
- https://openalex.org/W2107368146
- https://openalex.org/W2109293107
- https://openalex.org/W2112185869
- https://openalex.org/W2115477898
- https://openalex.org/W2122567081
- https://openalex.org/W2123139686
- https://openalex.org/W2133841550
- https://openalex.org/W2138070240
- https://openalex.org/W2140469848
- https://openalex.org/W2159048243
- https://openalex.org/W2167405945
- https://openalex.org/W4238583330
- https://openalex.org/W4293247451