Published December 4, 2020 | Version v1
Publication Open

Cell softness regulates tumorigenicity and stemness of cancer cells

Creators

  • 1. Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College
  • 2. Peking University
  • 3. Institute of Microelectronics
  • 4. Beijing Microelectronics Technology Institute
  • 5. Huazhong University of Science and Technology
  • 6. University of Illinois Urbana-Champaign

Description

Article4 December 2020Open Access Source DataTransparent process Cell softness regulates tumorigenicity and stemness of cancer cells Jiadi Lv Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaThese authors contributed equally to this work Search for more papers by this author Yaoping Liu Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, ChinaThese authors contributed equally to this work Search for more papers by this author Feiran Cheng orcid.org/0000-0001-9460-9949 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaThese authors contributed equally to this work Search for more papers by this author Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China Search for more papers by this author Yabo Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Tianzhen Zhang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Nannan Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Cong Li Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Zhenfeng Wang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Longfei Ma Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Mengyu Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Qiang Zhu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Xiaohan Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Ke Tang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jingwei Ma Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jing Xie Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Yi Fang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Haizeng Zhang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Ning Wang Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA Search for more papers by this author Yuying Liu Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0003-2182-7210 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Bo Huang Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0001-8476-1138 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Jiadi Lv Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaThese authors contributed equally to this work Search for more papers by this author Yaoping Liu Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, ChinaThese authors contributed equally to this work Search for more papers by this author Feiran Cheng orcid.org/0000-0001-9460-9949 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaThese authors contributed equally to this work Search for more papers by this author Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China Search for more papers by this author Yabo Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Tianzhen Zhang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Nannan Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Cong Li Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Zhenfeng Wang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Longfei Ma Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Mengyu Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Qiang Zhu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Xiaohan Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Ke Tang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jingwei Ma Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jing Xie Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Yi Fang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Haizeng Zhang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Ning Wang Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA Search for more papers by this author Yuying Liu Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0003-2182-7210 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Bo Huang Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0001-8476-1138 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Author Information Jiadi Lv1, Yaoping Liu2, Feiran Cheng1, Jiping Li3, Yabo Zhou1, Tianzhen Zhang1, Nannan Zhou1, Cong Li1, Zhenfeng Wang1, Longfei Ma1, Mengyu Liu1, Qiang Zhu1, Xiaohan Liu1, Ke Tang4, Jingwei Ma4, Huafeng Zhang4, Jing Xie1, Yi Fang5, Haizeng Zhang5, Ning Wang6, Yuying Liu *,1,7 and Bo Huang *,1,4,7 1Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China 2Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, China 3Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China 4Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China 5National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China 6Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA 7Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China *Corresponding author. Tel: +86 10 69156447; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: 86 10 69156464; E-mail: [email protected] EMBO J (2021)40:e106123https://doi.org/10.15252/embj.2020106123 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Identifying and sorting highly tumorigenic and metastatic tumor cells from a heterogeneous cell population is a daunting challenge. Here, we show that microfluidic devices can be used to sort marker-based heterogeneous cancer stem cells (CSC) into mechanically stiff and soft subpopulations. The isolated soft tumor cells (< 400 Pa) but not the stiff ones (> 700 Pa) can form a tumor in immunocompetent mice with 100 cells per inoculation. Notably, only the soft, but not the stiff cells, isolated from CD133+, ALDH+, or side population CSCs, are able to form a tumor with only 100 cells in NOD-SCID or immunocompetent mice. The Wnt signaling protein BCL9L is upregulated in soft tumor cells and regulates their stemness and tumorigenicity. Clinically, BCL9L expression is correlated with a worse prognosis. Our findings suggest that the intrinsic softness is a unique marker of highly tumorigenic and metastatic tumor cells. Synopsis Cellular stiffness has been associated with stem cell-like properties in development and cancer. Here, mechanical softness associated with high expression of the transcriptional regulator BCL9L is identified as a general marker of cancer stem cells. Microfluidic sorting allows tumor cell separation according to their mechanical stiffness. Soft tumor cells show increased tumorigenicity in vivo. BCL9L is a regulator of stemness in soft tumor cells. BCL9L levels and tumor cell softness correlate with disease progression in melanoma, breast and colon cancer patients. Introduction The notion of "cancer stem cells" or tumorigenic cells has been based on the observation that only a very small population of cells from a tumor can seed and form a tumor in severe combined immunodeficient (SCID) mice (Lapidot et al, 1994; Al-Hajj et al, 2003; Hope et al, 2004; Singh et al, 2004; O'Brien et al, 2007; Quintana et al, 2008; Schatton et al, 2008). These tumorigenic cells are viewed as the source of treatment resistance and relapse of a tumor, making them a tempting therapeutic target. However, despite intensive studies, the properties of this crucial tumor cell subset remain poorly understood. Furthermore, rigorous methods are not available to isolate these cells from a tumor, because the conventional cell surface markers are unreliable and highly variable among different cancers (Hope et al, 2004; Dieter Sebastian et al, 2011). Thus, developing a method that can effectively sort and define tumorigenic cells is extremely desirable. Published reports have highlighted the importance of the mechanical properties of a living cell in cell behaviors and functions (Engler et al, 2006; Chowdhury et al, 2010; Urbanska et al, 2017). It is known that cells apply actomyosin-dependent contractile forces in response to the increasing stiffness of the extracellular matrices (ECMs) (Discher et al, 2005; Irianto et al, 2016). Such endogenous contraction, in turn, can elevate cell stiffness (Wang et al, 1993). Moreover, to properly sense and respond to the surrounding mechanical cues, the stiffness of a cell should match that of the ECMs (Discher et al, 2005; Discher et al, 2009; Wu et al, 2018), suggesting that soft cells should survive in a soft stroma and stiff cells behave optimally in a stiff niche. As a support, we have demonstrated that 3D soft fibrin matrices promote H3K9 demethylation and increase Sox2 expression and self-renewal of melanoma stem cells, whereas stiff ones exert opposite effects (Tan et al, 2014). In line with this notion, cells with various degrees of stiffness can co-exist within the same tumor tissue, due to the heterogeneity of the tumor mechanical microenvironments (Plodinec et al, 2012; Elosegui-Artola et al, 2014). Despite such understanding, direct evidence that the cellular softness functions as a basic feature for tumorigenic cells remains elusive. In this study, we develop a method to separate soft cells from stiff ones and provide evidence that these soft cells are highly tumorigenic and possess the ability to metastasize. Results Soft tumor cells are sorted by microfluidic chip Indeed, atomic force microscopy (AFM) analysis showed that the stiffness of tumor cells in mouse breast cancer (4T1), human breast cancer (MCF-7), mouse B16 melanoma, and primary human melanoma (MP-1) was highly variable, ranging from 0.2 to 1.3 kPa. Notably, more than 60% of tumor cells had at least a stiffness of 0.7 kPa and less than 10% tumor cells had the stiffness below 0.4 kPa (Fig EV1A). Since the softness (the inverse of stiffness) renders a cell a greater degree of deformability, we thus rationally explored this as a way to separate soft tumor cells from stiff ones (Mohamed et al, 2009; Zhang et al, 2012). Click here to expand this figure. Figure EV1. Soft tumor cells are isolated by microfluidic chip The cellular stiffness of 4T1, MCF-7, B16F1, or MP-1 was detected by AFM. n = 100. The schematic illustration of PDMS microfluidic chip fabrication for four different types. The lower is the magnification of the indicated microfluidic channel. The number of soft B16 cells isolated from four different microfluidic chips at the same flow flux of 13 μl/min for 10 min (cell density, 1 × 104 cells/ml). The size of separated stiff and soft cells from 4T1, MCF-7, B16, or MP-1 bulk cells was measured. n = 10. The bulk, stiff, or soft B16 cells were cultured in 6-well plate for the indicated time periods. The soft and stiff 4T1 cells were isolated by microfluidic chip (before) and then mixed together to be separated again by microfluidic chip (after). The stiffness of 4T1 cells from before and after re-separation was detected by AFM. n = 100. The stiffness of 4T1, MCF-7, B16, and MP-1 cells treated with Cyto (5 μM) or Jas (50 nM) for 4 h or 12 h was measured by AFM. n = 100. The soft tumor cells were isolated by microfluidic chip from B16 or MP-1 cells pre-treated with Cyto (5 μM) or Jas (50 nM) for 4 h or 12 h. The number of soft tumor cells was counted. n = 3. Data information: N.S., no significant difference. Kruskal–Wallis test (G), Bonferroni test (C, D and H). The data represent mean ± SD of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint Here, we designed a unique microfluidic chip for label-free cell sorting based on the cells' physical characteristics (e.g. stiffness/deformability). The proposed microfluidic device consists of two major components, flow channels, and microweir structures (Fig 1A, upper). The gap between the microweir and main channel can act as a passive and selective barrier to isolate cells with a variety of stiffness (Fig 1A, lower). Considering that tumor cells usually have the size around 20–25 μm (Hosokawa et al, 2010; Hvichia et al, 2016), in this study, the microfluidic chips were fabricated with a 15 μm gap generation by setting the height of the microweir and flow channels at 25 and 40 μm, respectively. According to previous literatures (Mohamed et al, 2009; Zhang et al, 2012), four different types of chips (with different lengths, widths of microweir structure, spaces between microweir structures, and total numbers of microweir structures, shown in Fig EV1B and Table EV1) were designed and tested to perform the sorting. Cells (density ranging from 1 × 104 to 2 × 104/ml) with different degree of stiffness were injected into the chip via a syringe pump at a flow flux of 10 μl/min (Fig 1B). The cells, as they flowed out from the outlet, were collected as soft cells. In addition, we also pumped the bulk tumor cells through the microfluidic channels with a larger gap (18 μm), and inversely washed the channels. Cells then flowed out from backflow inlet and were collected as stiff cells (Fig 1B). To verify that these separated cells are authentically soft or stiff ones, we used AFM to measure the stiffness of cells. Indeed, the cells which flowed out from the outlet of each type of microtube were much softer than the cells which flowed out from the inlet (Fig 1C). Notably, the microfluidic tube #2 (260 μm distance between ridges and 11.44 mm channel length) displayed the highest sorting efficiency (Fig EV1C) and thus was used for the following experiments. Tumor cells isolated from melanoma (B16F1 and MP-1) and breast cancer (4T1 and MCF-7) by the microfluidic tube all displayed the soft trait (Fig 1D). We found that the separated stiff and soft cells had a similar cellular size (Fig EV1D). Also, the stiff and soft tumor cells displayed a similar growth curve in in vitro culture (Fig EV1E). Given that the stiffness of the isolated soft tumor cells was less than 0.4 kPa and the stiffness of the stiff cells was larger than 0.65 kPa, we defined soft cells as those with < 0.4 kPa stiffness and stiff cells as those with > 0.7 kPa stiffness in this study. In addition, we mixed the isolated soft and stiff cells for re-separation using the microfluidic chip. We found that the distribution of soft cells before re-separation was completely consistent with those following re-separation (Fig EV1F), indicating that this microfluidic tube does not alter the original stiffness of the cells. F-actin is an essential element that contributes to cellular stiffness (Wang et al, 1993). Cytochalasin D (Cyto), an inhibitor of actin polymerization, can decrease cell stiffness; In contrast, jasplakinolide (Jas), a natural cyclodepsipeptide that is a potent inducer of actin polymerization, can increase cell stiffness (Fig EV1G). Following the Cyto or Jas treatment of tumor cells (4T1, MCF-7, B16, or MP-1), the number of soft tumor cells from the outlet was increased by Cyto but decreased by Jas (Figs 1E and EV1H). Thus, a marginal population of tumor cells with the mechanical property of softness can be separated from the bulk cells using the microfluidic chip. Figure 1. Soft tumor cells are sorted by microfluidic chip Schematic of microfluidic chip. Schematic of working principle for cell screening based on stiffness differences. The screening efficiency of four different types of chip was detected in 4T1 cells. n = 100. The stiffness of cells screened from the outlet or backflow inlet was measured by AFM. n = 100. The number of soft 4T1 or MCF-7 cells from the outlet was calculated after treatment with or without Cyto (5 μM) or Jas (50 nM) for 4 h or 12 h, respectively. Data information: Mann–Whitney test (D), Kruskal–Wallis test (C) or one-way ANOVA (E). The data represent mean ± SD of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint Soft cells are highly tumorigenic and metastatic Next, we investigated the biological property of the soft tumor cells. Our previous studies had demonstrated that tumorigenic cells rather than differentiated tumor cells are selected and grow in 90 Pa soft 3D fibrin gels (Liu et al, 2012; Liu et al, 2018); and these selected cells are physically much softer than the differentiated counterparts and can be represented by CD133hi melanoma cells or ALDH+ breast cancer cells in vivo (Liu et al, 2018). These findings prompted us to hypothesize that mechanical softness might be a common feature for tumorigenic cells. To test this hypothesis, we seeded the soft or stiff tumor cells following separation by a microfluidic channel (B16, MP-1, 4T1, MCF-7) into the 90 Pa soft 3D fibrin gels. We found that greater than 95% of soft tumor cells could form colonies, while stiff tumor cells only formed few colonies with a much smaller size (Figs 2A and EV2A). Meanwhile, we found that the softness of the isolated soft MCF-7 cells could be kept in soft fibrin gels, while, the soft cells, if seeded in rigid culture plates for 4 h, started to become stiff and reached the stiff peak 12 h later. Next, we injected 100 separated soft or stiff cells (4T1 and MCF-7) into the mammary fat pads of NOD/SCID IL-2Rγ-null (NSG) mice. Twelve weeks later, the 100 soft cells could form a tumor in situ with a relatively high frequency (6/10 for 4T1, 4/10 for MCF-7), while the 100 stiff cells injected did not form a tumor (Fig 2B). Moreover, 100 soft 4T1 cells could even form a tumor in immunocompetent mice (wild-type BALB/c) with a rate of tumor formation (3/8), suggesting that the soft tumor cells have a highly tumorigenic ability. In addition, when we performed limiting dilution experiments to quantify the frequency of tumors for each condition of soft or stiff cell inoculation (O'Brien et al, 2007), we found that the highest frequency of tumor formation occurred in the soft cell group (Fig 2C). Moreover, by conducting serial transplants with 100 soft tumor cells, we found that the tumor size and appearance of the first implantation was similar to the second and third generation of passaged tumors in the mice (Figs 2D and EV2D). A cardinal feature of malignant melanoma is its inclination to metastasize to the lungs. Eight weeks following an intravenous injection of 100 soft or stiff cells separated from B16-F1 or MP-1 in NSG mice, metastatic tumors in the lungs were visible from the soft cell group. Interestingly, even as few as 10 soft cells could generate metastatic tumors (2/12 for B16 or 2/8 for MP-1), but no metastatic tumors were detected in the lungs following the injection of 100 stiff cells (Fig 2E and F). Then, we used the 4T1 cell lung metastasis model to further validate this result. The soft or stiff 4T1 cells were injected into the mammary fat pads of WT BALB/c mice. Eight weeks later, the mice were sacrificed for H&E staining of the lungs, showing metastatic tumors (4/8) in the soft cell group (Fig EV2E and F). However, no lung metastatic tumors (0/8) were observed in the stiff cell group. In line with these in vivo results, the soft tumor cells displayed greater ability to migrate and invade in vitro, compared with the stiff cells (Fig EV2G–I). Together, these data suggest that soft tumor cells are highly tumorigenic in their ability to form a tumor at both primary and metastatic sites. Figure 2. Soft tumor cells have the ability to form tumors in mice Soft or stiff 4T1 or MCF-7 cells were isolated by the microfluidic chip, and then seeded (500 cells) in 90 Pa soft 3D fibrin gel for 3 days. The percentage of colonies formed was calculated and the colony size was recorded. Scale bar, 100 μm. The soft or stiff 4T1 or MCF-7 cells (100 cells) were injected into the mammary fat pads of NSG or BALB/c mice. Twelve weeks later, the tumor formation was recorded. n = 8–10. The same as (B), except that different number of 4T1 cells were injected into the BALB/c mice. n = 10. The tumor-forming capacity from primary xenografts (F1) and tumors passaged into secondary (F2) and tertiary (F3) recipients induced by injecting 100 soft 4T1 or B16 cells into the BALB/c or C57BL/6 mice. n = 10. Stiff or soft B16 or MP-1 cells (100 or 10 cells) were injected into the NSG mice by tail veil. n = 8–12. NSG mice were intravenously injected with 100 soft or stiff B16 or MP-1 cells. Eight weeks later, the lung metastasis was analyzed by H&E staining. The metastasis index was defined as the percentage of total metastatic nodule area to the total lung area based on the calculation from 10 slides. Scale bar, 0.5 mm. n = 3 (for B16) or 5 (for MP-1) mice with metastatic tumor. Data information: Two-tailed Paired Student's t-test (A and F). The data represent mean ± SD. n = 3 independent experiments in (A). Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV2. Soft tumor cells have a greater ability to migrate and invade compared with the stiff cells A. The stiff or soft B16 or MP-1 cells were isolated by microfluidic chip, and then 500 soft or stiff cells were seeded in a 90 Pa soft 3D fibrin gel for 3 days. The percentage of colony formation was calculated, and the colony size was recorded. Scale bar, 100 μm. n = 3 for colony number and 10 for colony size. B, C. Soft MCF-7 cells isolated by the microfluidic chip were cultured in soft 3D fibrin gel (B) or rigid flask (C) for 4, 6, 12, 24, 48, 72, and 96 h. Stiffness of the cells was determined by AFM. n = 100. D. The tumor-forming capacity from primary xenografts (F1) and tumors passaged into secondary (F2) and tertiary (F3) recipients induced by injecting 100 soft MCF-7 or MP-1 cells into NSG mice. n = 10. E, F. 100 stiff or soft 4T1 cells were injected into the mammary fat pads of BALB/c (E) or NSG (F) mice (n = 8). Eight weeks later, the lung metastasis was counted (E) and analyzed by H&E staining (F), n = 6 mice with metastatic tumor. Scale bar, 0.5 mm. G. The soft or stiff B16-F1, MP-1, 4T1, or MCF-7 cells were grown to confluence. Then, cells were scratched and wound closure was recorded at 24 h by phase contrast microscopy. Representative images of are shown. Wound closure was calculated using ImageJ software and expressed as a percentage of the initial scratched area. Scale bar, 250 μm. n = 10. H. The stiff or soft 4T1, MCF-7, B16-F1, or MP-1 cells were added into the hanging insert for 24 h (4T1) or 48 h (MCF-7, B16-F1, or MP-1). Then, the non-migrating cells were removed from the upper surface of the membrane, and cells that migrated through the 8 µm pore membrane were fixed and stained with 0.1% crystal violet. Scale bar, 50 μm. n = 3. I. The stiff or soft 4T1 or MP-1 cells were added to the top of a matrigel invasion chamber for 24 h or 48 h. Then, the non-invasive cells were removed from the upper sur

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

مقالة - سلعة 4 ديسمبر 2020 بيانات مصدر الوصول المفتوحعملية شفافة تنظم ليونة الخلية تولد الأورام ونمو الخلايا السرطانية قسم جيادي لف لعلم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي في هذا العمل البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف معهد ياوبينغ ليو للإلكترونيات الدقيقة، جامعة بكين، بكين، الصين ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي في هذا العمل البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف فييران تشنغ orcid.org/0000-0001-9460-9949 قسم علم المناعة و المختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي في هذا العمل البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جبينج لي بكين سمارت شيب شركة تكنولوجيا الإلكترونيات الدقيقة المحدودة، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف يابو تشو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تيانزين تشانغ قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف نانان تشو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف كونغ لي قسم علم المناعة والمفتاح الوطني مختبر البيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تشن فنغ وانغ قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف لونغ فاي ما قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف مينغيو ليو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تشيانغ تشو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث لمزيد من الأبحاث من قبل هذا المؤلف شياوهان ليو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف كي تانغ قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جينغوي ما قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف هوافينغ قسم تشانغ للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف قسم جينغ شيه لعلم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف مركز يي فانغ الوطني للسرطان/مستشفى السرطان، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف مركز هايزنغ تشانغ الوطني للسرطان/مستشفى السرطان، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق التي كتبها هذا المؤلف نينغ وانغ Deaprtment للعلوم والتكنولوجيا الميكانيكية، كلية غرينجر للهندسة، جامعة إلينوي في أوربانا شامبين، أوربانا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية البحث عن المزيد من الأوراق التي كتبها هذا المؤلف يوينغ ليو المؤلف المراسل [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0003-2182-7210 قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب اتحاد بكين، بكين، الصين مركز المناعة السريرية، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق التي كتبها هذا المؤلف بوانغ المقابلة المؤلف [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0001-8476-1138 قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، قسم الصين للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، مركز الصين لعلم المناعة السريرية، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جيادي لف قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي في هذا العمل البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف معهد ياوبينغ ليو للإلكترونيات الدقيقة، جامعة بكين، بكين، الصين ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي في هذا العمل البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف فييران تشنغ orcid.org/0000-0001-9460-9949 قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي في هذا العمل البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics شركة التكنولوجيا المحدودة، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف يابو تشو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تيانزين تشانغ قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف ننان تشو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق التي كتبها هذا المؤلف كونغ لي قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق التي كتبها هذا المؤلف تشن فنغ وانغ قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد البيولوجيا الجزيئية الأساسية العلوم الطبية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف قسم لونغفي ما لعلم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف قسم منغيو ليو لعلم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تشيانغ تشو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف شياوهان ليو قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف كي تانغ قسم الكيمياء الحيوية والجزيئية علم الأحياء، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازهونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جينغوي ما قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازهونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف هوافنغ تشانغ قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازهونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جينغ شيه قسم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف يي فانغ المركز الوطني للسرطان/مستشفى السرطان، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف هايزنغ تشانغ المركز الوطني للسرطان/مستشفى السرطان، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف نينغ وانغ Deaprtment للعلوم والتكنولوجيا الميكانيكية، كلية غرينجر للهندسة، جامعة إلينوي في أوربانا شامبين، أوربانا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف يوينغ ليو المؤلف المراسل [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0003-2182-7210 قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين مركز علم المناعة السريرية، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف بو هوانغ المؤلف المراسل [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0001-8476-1138 قسم علم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين مركز المناعة السريرية، CAMS، بكين، الصين البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف معلومات جيادي المستوى 1، ياوبينغ ليو 2، فييران تشنغ 1، جيبينغ لي 3، يابو تشو 1، تيانزين تشانغ 1، نانان تشو 1، كونغ لي 1، تشنفنغ وانغ 1، لونغفي ما 1، مينغيو ليو 1، تشيانغ تشو 1، شياوهان ليو 1، كه تانغ 4، جينغوي ما 4، هوافينغ تشانغ 4، جينغ شي 1، يي فانغ 5، هايزنغ تشانغ 5، نينغ وانغ 6، يويينغ ليو *، 1،7 وبو هوانغ *، 1،4،7 1 قسم المناعة والمختبر الوطني الرئيسي للبيولوجيا الجزيئية الطبية، معهد العلوم الطبية الأساسية، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) وكلية الطب في اتحاد بكين، بكين، الصين 2 معهد الإلكترونيات الدقيقة، جامعة بكين، بكين، الصين 3 شركة بكين لتكنولوجيا الإلكترونيات الدقيقة الذكية المحدودة، بكين، الصين 4 قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية تونغجي الطبية، جامعة هوازونغ للعلوم والتكنولوجيا، ووهان، الصين 5 المركز الوطني للسرطان/مستشفى السرطان، CAMS، بكين، الصين 6 قسم العلوم والتكنولوجيا الميكانيكية، كلية جرينجر للهندسة، جامعة إلينوي في أوربانا- شامبين، أوربانا، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية 7 مركز المناعة السريرية، CAMS، بكين، الصين *المؤلف المقابل. هاتف: +86 10 69156447 ؛ البريد الإلكتروني: [البريد الإلكتروني محمي] * المؤلف المراسل. هاتف: 86 10 69156464 ؛ البريد الإلكتروني: [البريد الإلكتروني محمي] EMBO J (2021)40: e106123https://doi.org/10.15252/embj.2020106123 PDFتنزيل ملف PDF لنص المقالة والأشكال الرئيسية. مراجعة الأقرانتحميل ملخص لعملية قرار التحرير بما في ذلك خطابات قرار التحرير وتعليقات المراجع وردود المؤلف على الملاحظات. أدواتإضافة إلى المفضلةتنزيل الاستشهاداتتتبع الاستشهاداتمشاركة الأذوناتفيس بوكتويتررابط فيمنديليشيتأرقام ومعلومات خلاصة تحديد وفرز الخلايا السرطانية شديدة الورم والنقيلية من مجموعة خلايا غير متجانسة يمثل تحديًا شاقًا. هنا، نوضح أنه يمكن استخدام أجهزة الموائع الدقيقة لفرز الخلايا الجذعية السرطانية غير المتجانسة القائمة على العلامات (CSC) إلى مجموعات فرعية صلبة وناعمة ميكانيكيًا. يمكن للخلايا السرطانية الرخوة المعزولة (< 400 باسكال) ولكن ليس الخلايا الصلبة (> 700 باسكال) أن تشكل ورمًا في الفئران المؤهلة مناعيًا مع 100 خلية لكل لقاح. والجدير بالذكر أن الخلايا الرخوة فقط، ولكن ليس الخلايا المتصلبة، المعزولة عن CD133 +، ALDH+، أو الخلايا الجذعية المكونة للجانب، قادرة على تكوين ورم يحتوي على 100 خلية فقط في NOD - SCID أو الفئران ذات الكفاءة المناعية. يتم إعادة تنظيم بروتين إشارات WNT BCL9L في الخلايا السرطانية الرخوة وينظم جذوعها وتولدها للأورام. سريريًا، يرتبط تعبير BCL9L بتكهن أسوأ. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن النعومة الذاتية هي علامة فريدة للخلايا السرطانية شديدة الورم والنقيلية. ارتبطت الصلابة الخلوية بخصائص تشبه الخلايا الجذعية في التطور والسرطان. هنا، يتم تحديد النعومة الميكانيكية المرتبطة بالتعبير العالي لمنظم النسخ BCL9L كعلامة عامة للخلايا الجذعية السرطانية. يسمح الفرز بالموائع الدقيقة بفصل خلايا الورم وفقًا لصلابتها الميكانيكية. تظهر الخلايا السرطانية الرخوة زيادة في تولد الأورام في الجسم الحي. BCL9L هو منظم للجذع في الخلايا السرطانية الرخوة. ترتبط مستويات BCL9L ونعومة خلايا الورم بتطور المرض في مرضى سرطان الجلد والثدي وسرطان القولون. مقدمة استند مفهوم "الخلايا الجذعية السرطانية" أو الخلايا المسببة للأورام إلى ملاحظة أن مجموعة صغيرة جدًا فقط من الخلايا من الورم يمكن أن تبذر وتشكل ورمًا في الفئران المصابة بنقص مناعي شديد (Lapidot et al, 1994; Al - Hajj et al, 2003; Hope et al, 2004; Singh et al, 2004; O'Brien et al, 2007; Quintana et al, 2008; Schatton et al, 2008). يُنظر إلى هذه الخلايا السرطانية على أنها مصدر مقاومة العلاج وانتكاس الورم، مما يجعلها هدفًا علاجيًا مغريًا. ومع ذلك، على الرغم من الدراسات المكثفة، لا تزال خصائص هذه المجموعة الفرعية الحاسمة من خلايا الورم غير مفهومة بشكل جيد. علاوة على ذلك، لا تتوفر طرق صارمة لعزل هذه الخلايا عن الورم، لأن علامات سطح الخلية التقليدية غير موثوقة ومتغيرة للغاية بين السرطانات المختلفة (هوب وآخرون، 2004 ؛ ديتر سيباستيان وآخرون، 2011). وبالتالي، فإن تطوير طريقة يمكنها فرز الخلايا السرطانية وتحديدها بشكل فعال أمر مرغوب فيه للغاية. سلطت التقارير المنشورة الضوء على أهمية الخواص الميكانيكية للخلية الحية في سلوكيات الخلية ووظائفها (إنجلر وآخرون، 2006 ؛ تشودري وآخرون، 2010 ؛ أوربانسكا وآخرون، 2017). من المعروف أن الخلايا تطبق قوى انقباضية تعتمد على الأكتوميوسين استجابةً للتصلب المتزايد للمصفوفات خارج الخلية (Discher et al, 2005; Irianto et al, 2016). هذا الانكماش الداخلي، بدوره، يمكن أن يزيد من تصلب الخلايا (وانغ وآخرون، 1993). علاوة على ذلك، من أجل الاستشعار والاستجابة بشكل صحيح للإشارات الميكانيكية المحيطة، يجب أن تتطابق صلابة الخلية مع صلابة وحدات التحكم في المحرك (Discher et al، 2005 ؛ Discher et al، 2009 ؛ Wu et al، 2018)، مما يشير إلى أن الخلايا اللينة يجب أن تعيش في سدى ناعم والخلايا المتصلبة تتصرف على النحو الأمثل في مكان صلب. كدعم، أثبتنا أن مصفوفات الفيبرين اللينة ثلاثية الأبعاد تعزز إزالة الميثيل H3K9 وتزيد من تعبير Sox2 والتجديد الذاتي للخلايا الجذعية للورم الميلانيني، في حين أن الخلايا الصلبة تمارس تأثيرات عكسية (Tan et al، 2014). تماشياً مع هذه الفكرة، يمكن أن تتعايش الخلايا ذات الدرجات المختلفة من الصلابة داخل نفس نسيج الورم، بسبب عدم تجانس البيئات الدقيقة الميكانيكية للورم (Plodinec et al، 2012 ؛ Elosegui - Artola et al، 2014). على الرغم من هذا الفهم، لا يزال الدليل المباشر على أن النعومة الخلوية تعمل كميزة أساسية للخلايا المسببة للأورام بعيد المنال. في هذه الدراسة، نقوم بتطوير طريقة لفصل الخلايا الرخوة عن الخلايا الصلبة وتقديم دليل على أن هذه الخلايا الرخوة شديدة الأورام وتمتلك القدرة على الانتشار. النتائج يتم فرز الخلايا السرطانية الرخوة بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة في الواقع، أظهر تحليل مجهر القوة الذرية (AFM) أن صلابة الخلايا السرطانية في سرطان ثدي الفأر (4T1)، وسرطان الثدي البشري (MCF -7)، والورم الميلانيني للفأر B16، والورم الميلانيني البشري الأولي (MP -1) كانت متغيرة للغاية، وتتراوح من 0.2 إلى 1.3 كيلو باسكال. والجدير بالذكر أن أكثر من 60 ٪ من الخلايا السرطانية لديها صلابة لا تقل عن 0.7 كيلو باسكال وأقل من 10 ٪ من الخلايا السرطانية لديها صلابة أقل من 0.4 كيلو باسكال (الشكل EV1A). نظرًا لأن النعومة (عكس الصلابة) تجعل الخلية درجة أكبر من التشوه، فقد استكشفنا هذا بعقلانية كطريقة لفصل الخلايا السرطانية الرخوة عن الخلايا الصلبة (محمد وآخرون، 2009 ؛ تشانغ وآخرون، 2012). انقر هنا لتوسيع هذا الشكل. الشكل EV1. يتم عزل الخلايا السرطانية الرخوة بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة تم اكتشاف الصلابة الخلوية لـ 4T1 أو MCF -7 أو B16F1 أو MP -1 بواسطة AFM. العدد = 100. الرسم التوضيحي التخطيطي لتصنيع رقائق السوائل الدقيقة PDMS لأربعة أنواع مختلفة. والجزء السفلي هو تكبير القناة المائعية الدقيقة المشار إليها. عدد خلايا B16 الناعمة المعزولة من أربع رقائق ميكروفلويديك مختلفة عند نفس تدفق التدفق البالغ 13 ميكرولتر/دقيقة لمدة 10 دقائق (كثافة الخلية، 1 × 104 خلية/مل). تم قياس حجم الخلايا الصلبة واللينة المنفصلة من الخلايا السائبة 4T1 أو MCF -7 أو B16 أو MP -1. العدد = 10. تم استزراع الخلايا السائبة أو المتصلبة أو الرخوة B16 في صفيحة من 6 آبار للفترات الزمنية المشار إليها. تم عزل الخلايا الرخوة والصلبة 4T1 بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة (قبل) ثم خلطها معًا لفصلها مرة أخرى بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة (بعد). تم اكتشاف صلابة خلايا 4T1 من قبل وبعد إعادة الفصل بواسطة AFM. n = 100. تم قياس صلابة الخلايا 4T1 و MCF -7 و B16 و MP -1 المعالجة بالخلايا (5 ميكرومتر) أو JAS (50 نانومتر) لمدة 4 ساعات أو 12 ساعة بواسطة AFM. n = 100. تم عزل الخلايا السرطانية الرخوة بواسطة رقاقة السوائل الدقيقة من خلايا B16 أو MP -1 المعالجة مسبقًا بـ Cyto (5 ميكرومتر) أو Jas (50 نانومتر) لمدة 4 ساعات أو 12 ساعة. تم حساب عدد الخلايا السرطانية الرخوة. العدد = 3. معلومات البيانات: N.S.، لا يوجد فرق كبير. اختبار Kruskal - Wallis (G)، اختبار Bonferroni (C و D و H). تمثل البيانات متوسط ± الانحراف المعياري لثلاث تجارب مستقلة. تنزيل الشكل تنزيل العرض التقديمي هنا، قمنا بتصميم شريحة ميكروفلويديك فريدة لفرز الخلايا الخالية من الملصقات بناءً على الخصائص الفيزيائية للخلايا (مثل الصلابة/التشوه). يتكون جهاز الموائع الدقيقة المقترح من مكونين رئيسيين، قنوات التدفق، وهياكل الأسلاك الدقيقة (الشكل 1 أ، الجزء العلوي). يمكن أن تعمل الفجوة بين السلك الصغير والقناة الرئيسية كحاجز سلبي وانتقائي لعزل الخلايا مع مجموعة متنوعة من الصلابة (الشكل 1 أ، أقل). بالنظر إلى أن الخلايا السرطانية عادة ما يكون حجمها حوالي 20–25 ميكرومتر (هوسوكاوا وآخرون، 2010 ؛ هفيتشيا وآخرون، 2016)، في هذه الدراسة، تم تصنيع رقائق الموائع الدقيقة مع توليد فجوة 15 ميكرومتر من خلال تحديد ارتفاع السلك المجهري وقنوات التدفق عند 25 و 40 ميكرومتر، على التوالي. وفقًا للآداب السابقة (محمد وآخرون، 2009 ؛ تشانغ وآخرون، 2012)، تم تصميم واختبار أربعة أنواع مختلفة من الرقائق (بأطوال مختلفة، وعرض بنية الأسلاك الدقيقة، والمسافات بين هياكل الأسلاك الدقيقة، والأعداد الإجمالية لهياكل الأسلاك الدقيقة، الموضحة في الشكل EV1B والجدول EV1) لإجراء الفرز. تم حقن الخلايا (بكثافة تتراوح من 1 × 104 إلى 2 × 104/مل) بدرجة مختلفة من الصلابة في الشريحة عبر مضخة حقنة عند تدفق تدفق 10 ميكرولتر/دقيقة (الشكل 1 ب). تم جمع الخلايا، أثناء تدفقها من المخرج، كخلايا لينة. بالإضافة إلى ذلك، قمنا أيضًا بضخ الخلايا السرطانية السائبة من خلال القنوات المائعية الدقيقة بفجوة أكبر (18 ميكرومتر)، وغسلنا القنوات عكسياً. ثم تدفقت الخلايا من مدخل التدفق العكسي وتم جمعها كخلايا صلبة (الشكل 1 ب). للتحقق من أن هذه الخلايا المنفصلة هي خلايا لينة أو صلبة أصلاً، استخدمنا AFM لقياس صلابة الخلايا. في الواقع، كانت الخلايا التي تتدفق من مخرج كل نوع من الأنابيب الدقيقة أكثر ليونة بكثير من الخلايا التي تتدفق من المدخل (الشكل 1 ج). والجدير بالذكر أن الأنبوب المائعي الدقيق رقم2 (مسافة 260 ميكرومتر بين التلال وطول قناة 11.44 مم) أظهر أعلى كفاءة فرز (الشكل EV1C) وبالتالي تم استخدامه للتجارب التالية. أظهرت الخلايا السرطانية المعزولة من الميلانوما (B16F1 و MP -1) وسرطان الثدي (4T1 و MCF -7) بواسطة الأنبوب المائعي الدقيق السمة الرخوة (الشكل 1D). وجدنا أن الخلايا الصلبة واللينة المنفصلة لها حجم خلوي مماثل (الشكل EV1D). كما أظهرت الخلايا السرطانية المتصلبة والناعمة منحنى نمو مشابه في المزرعة المختبرية (الشكل EV1E). بالنظر إلى أن صلابة الخلايا السرطانية الرخوة المعزولة كانت أقل من 0.4 كيلو باسكال وأن صلابة الخلايا الصلبة كانت أكبر من 0.65 كيلو باسكال، فقد عرّفنا الخلايا الرخوة على أنها الخلايا التي لديها صلابة وتصلب أقل من 0.4 كيلو باسكال مثل تلك التي لديها صلابة أكبر من 0.7 كيلو باسكال في هذه الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بخلط الخلايا الرخوة والصلبة المعزولة لإعادة الفصل باستخدام شريحة الموائع الدقيقة. وجدنا أن توزيع الخلايا الرخوة قبل إعادة الفصل كان متسقًا تمامًا مع تلك التي تلي إعادة الفصل (الشكل EV1F)، مما يشير إلى أن هذا الأنبوب المائعي الدقيق لا يغير الصلابة الأصلية للخلايا. و- الأكتين هو عنصر أساسي يساهم في التصلب الخلوي (وانغ وآخرون، 1993). يمكن أن يقلل سيتوكالاسين د (Cyto)، وهو مثبط لبلمرة الأكتين، من تصلب الخلايا ؛ في المقابل، يمكن أن يزيد جاسبلاكينوليد (JAS)، وهو سيكلوديببتيد طبيعي محفز قوي لبلمرة الأكتين، من تصلب الخلايا (الشكل EV1G). بعد العلاج الخلوي أو JAS للخلايا السرطانية (4T1، MCF -7، B16، أو MP -1)، زاد عدد الخلايا السرطانية الرخوة من المخرج بواسطة Cyto ولكن انخفض بنسبة JAS (الشكلين 1E و EV1H). وبالتالي، يمكن فصل مجموعة هامشية من الخلايا السرطانية ذات الخاصية الميكانيكية للنعومة عن الخلايا السائبة باستخدام رقاقة الموائع الدقيقة. الشكل 1. يتم فرز الخلايا السرطانية الرخوة بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة تخطيطي من رقاقة الموائع الدقيقة. رسم تخطيطي لمبدأ العمل لفحص الخلايا بناءً على اختلافات الصلابة. تم الكشف عن كفاءة الغربلة لأربعة أنواع مختلفة من الشرائح في خلايا 4T1. العدد = 100. تم قياس صلابة الخلايا التي تم فحصها من المخرج أو مدخل التدفق العكسي بواسطة AFM. n = 100. تم حساب عدد الخلايا الرخوة 4T1 أو MCF -7 من المخرج بعد العلاج باستخدام أو بدون Cyto (5 ميكرومتر) أو JAS (50 نانومتر) لمدة 4 ساعات أو 12 ساعة على التوالي. معلومات البيانات: اختبار مان ويتني (د) أو اختبار كروسكال واليس (ج) أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (هـ). تمثل البيانات متوسط ± الانحراف المعياري لثلاث تجارب مستقلة. رقم التنزيل تحميل باور بوينت الخلايا اللينة شديدة الأورام والنقائل بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في الخاصية البيولوجية للخلايا السرطانية اللينة. أظهرت دراساتنا السابقة أن الخلايا السرطانية المنشأ بدلاً من الخلايا السرطانية المتمايزة يتم اختيارها وتنمو في 90 باسكال من جل الفيبرين ثلاثي الأبعاد الناعم (ليو وآخرون، 2012 ؛ ليو وآخرون، 2018 )؛ وهذه الخلايا المختارة أكثر ليونة جسديًا من نظيراتها المتمايزة ويمكن تمثيلها بخلايا سرطان الجلد CD133hi أو خلايا سرطان الثدي ALDH+ في الجسم الحي (ليو وآخرون، 2018). دفعتنا هذه النتائج إلى افتراض أن النعومة الميكانيكية قد تكون سمة شائعة للخلايا المسببة للأورام. لاختبار هذه الفرضية، قمنا ببذر الخلايا السرطانية الرخوة أو المتصلبة بعد الانفصال عن طريق قناة الموائع الدقيقة (B16، MP -1، 4T1، MCF -7) في هلام الليفين ثلاثي الأبعاد الناعم 90 باسكال. وجدنا أن أكثر من 95 ٪ من الخلايا السرطانية الرخوة يمكن أن تشكل مستعمرات، في حين أن الخلايا السرطانية المتصلبة شكلت فقط عددًا قليلاً من المستعمرات ذات حجم أصغر بكثير (الشكلان 2A و EV2A). وفي الوقت نفسه، وجدنا أن ليونة خلايا MCF -7 الناعمة المعزولة يمكن الاحتفاظ بها في هلام الفيبرين الناعم، في حين أن الخلايا الرخوة، إذا تم زرعها في صفائح مزرعة صلبة لمدة 4 ساعات، بدأت تصبح قاسية ووصلت إلى الذروة الصلبة بعد 12 ساعة. بعد ذلك، قمنا بحقن 100 خلية لينة أو متصلبة منفصلة (4T1 و MCF -7) في منصات الدهون الثديية لفئران NOME/SCID IL -2Rγ - null (NSG). بعد اثني عشر أسبوعًا، يمكن أن تشكل 100 خلية لينة ورمًا في الموقع بتردد مرتفع نسبيًا (6/10 لـ 4T1، 4/10 لـ MCF -7)، في حين أن 100 خلية صلبة تم حقنها لم تشكل ورمًا (الشكل 2B). علاوة على ذلك، يمكن أن تشكل 100 خلية رخوة 4T1 ورمًا في الفئران المؤهلة مناعيًا (BALB/c من النوع البري) بمعدل تكوين ورم (3/8)، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية الرخوة لديها قدرة عالية على تكوين الورم. بالإضافة إلى ذلك، عندما أجرينا تجارب تخفيف محدودة لتحديد تواتر الأورام لكل حالة من حالات تلقيح الخلايا الرخوة أو المتصلبة (أوبراين وآخرون، 2007)، وجدنا أن أعلى تواتر لتكوين الورم حدث في مجموعة الخلايا الرخوة (الشكل 2 ج). علاوة على ذلك، من خلال إجراء عمليات زرع متسلسلة مع 100 خلية ورمية رخوة، وجدنا أن حجم الورم ومظهر الزرع الأول كان مشابهًا للجيل الثاني والثالث من الأورام المارة في الفئران (الشكلان 2D و EV2D). السمة الأساسية للورم الميلانيني الخبيث هي ميله إلى الانتشار إلى الرئتين. بعد ثمانية أسابيع من الحقن الوريدي لـ 100 خلية رخوة أو متصلبة مفصولة عن B16 - F1 أو MP -1 في فئران مجموعة موردي المواد النووية، كانت الأورام المنتشرة في الرئتين مرئية من مجموعة الخلايا الرخوة. ومن المثير للاهتمام أنه حتى عدد قليل من 10 خلايا لينة يمكن أن تولد أورامًا نقيلية (2/12 لـ B16 أو 2/8 لـ MP -1)، ولكن لم يتم اكتشاف أي أورام نقيلية في الرئتين بعد حقن 100 خلية صلبة (الشكل 2E و F). بعد ذلك، استخدمنا نموذج نقائل الرئة لخلية 4T1 لمزيد من التحقق من صحة هذه النتيجة. تم حقن الخلايا الرخوة أو المتصلبة 4T1 في منصات الدهون الثديية لفئران WT BALB/c. بعد ثمانية أسابيع، تم التضحية بالفئران من أجل تلطيخ الرئتين H&E، مما أظهر أورامًا نقيلية (4/8) في مجموعة الخلايا الرخوة (الشكل EV2E و F). ومع ذلك، لم يلاحظ أي أورام نقيلية في الرئة (0/8) في مجموعة الخلايا المتصلبة. تماشياً مع هذه النتائج في الجسم الحي، أظهرت الخلايا السرطانية الرخوة قدرة أكبر على الهجرة والغزو في المختبر، مقارنة بالخلايا المتصلبة (الشكل EV2G - I). تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن الخلايا السرطانية الرخوة شديدة التولد للأورام في قدرتها على تكوين ورم في كل من المواقع الأولية والنقيلية. الشكل 2. الخلايا السرطانية الرخوة لديها القدرة على تكوين أورام في الفئران تم عزل الخلايا الرخوة أو الصلبة 4T1 أو MCF -7 بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة، ثم تم زرعها (500 خلية) في 90 باسكال هلام ليفي ثلاثي الأبعاد لمدة 3 أيام. تم حساب نسبة المستعمرات المتكونة وتسجيل حجم المستعمرة. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. تم حقن الخلايا الرخوة أو المتصلبة 4T1 أو MCF -7 (100 خلية) في منصات الدهون الثديية لفئران NSG أو BALB/c. بعد اثني عشر أسبوعًا، تم تسجيل تكوين الورم. ن = 8–10. مثل (B)، باستثناء أنه تم حقن عدد مختلف من خلايا 4T1 في فئران BALB/c. n = 10. قدرة تكوين الورم من الطعوم الأجنبية الأولية (F1) والأورام التي تنتقل إلى المتلقين الثانويين (F2) والثالث (F3) المستحثة عن طريق حقن 100 خلية لينة 4T1 أو B16 في BALB/c أو C57BL/6 الفئران. ن = 10. تم حقن الخلايا الصلبة أو الرخوة B16 أو MP -1 (100 أو 10 خلايا) في فئران مجموعة موردي المواد النووية بواسطة حجاب الذيل. ن = 8–12. تم حقن فئران مجموعة موردي المواد النووية عن طريق الوريد بـ 100 خلية لينة أو قاسية B16 أو MP -1. بعد ثمانية أسابيع، تم تحليل ورم خبيث في الرئة عن طريق تلطيخ H&E. تم تعريف مؤشر النقائل على أنه النسبة المئوية لإجمالي مساحة العقيدات النقيلية إلى إجمالي منطقة الرئة بناءً على الحساب من 10 شرائح. شريط المقياس، 0.5 مم. العدد = 3 (لـ B16) أو 5 (لـ MP -1) فئران مصابة بورم نقيلي. معلومات البيانات: اختبار t للطالب المقترن ثنائي الذيل (A و F). تمثل البيانات متوسط ± SD. ن = 3 تجارب مستقلة في (أ). قم بتنزيل الشكل قم بتنزيل PowerPoint انقر هنا لتوسيع هذا الشكل. الشكل EV2. تتمتع الخلايا السرطانية الرخوة بقدرة أكبر على الهجرة والغزو مقارنة بالخلايا المتصلبة A. تم عزل الخلايا المتصلبة أو الرخوة B16 أو MP -1 بواسطة رقاقة السوائل الدقيقة، ثم تم زرع 500 خلية رخوة أو متصلبة في هلام فبرين ثلاثي الأبعاد ناعم 90 باسكال لمدة 3 أيام. تم حساب نسبة تكوين المستعمرة وتسجيل حجم المستعمرة. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. ن = 3 لرقم المستعمرة و 10 لحجم المستعمرة. ب، ج. تم استزراع خلايا MCF -7 الناعمة المعزولة بواسطة رقاقة الموائع الدقيقة في هلام فبرين ثلاثي الأبعاد ناعم (ب) أو قارورة صلبة (ج) لمدة 4 و 6 و 12 و 24 و 48 و 72 و 96 ساعة. تم تحديد تصلب الخلايا بواسطة AFM. n = 100. د. قدرة تكوين الورم من الطعوم الأجنبية الأولية (F1) والأورام التي تنتقل إلى المتلقين الثانويين (F2) والثالث (F3) المستحثة عن طريق حقن 100 خلية MCF -7 أو MP -1 الناعمة في فئران مجموعة موردي المواد النووية. العدد = 10. تم حقن 100 خلية صلبة أو ناعمة من 4T1 في منصات الدهون الثديية لفئران BALB/c (E) أو NSG (F) (العدد = 8). بعد ثمانية أسابيع، تم عد ورم خبيث في الرئة (E) وتحليله بواسطة تلوين H&E (F)، n = 6 فئران مصابة بورم خبيث. شريط المقياس، 0.5 مم. ز. نمت الخلايا الرخوة أو المتصلبة B16 - F1 أو MP -1 أو 4T1 أو MCF -7 للالتقاء. بعد ذلك، تم خدش الخلايا وتسجيل إغلاق الجرح في 24 ساعة عن طريق الفحص المجهري لتباين الطور. يتم عرض الصور التمثيلية لـ. تم حساب إغلاق الجرح باستخدام برنامج ImageJ وتم التعبير عنه كنسبة مئوية من المنطقة الأولية المخدوشة. شريط المقياس، 250 ميكرومتر. ن = 10. ح. تمت إضافة الخلايا الصلبة أو الرخوة 4T1 أو MCF -7 أو B16 - F1 أو MP -1 إلى وليجة التعليق لمدة 24 ساعة (4T1) أو 48 ساعة (MCF -7 أو B16 - F1 أو MP -1). بعد ذلك، تمت إزالة الخلايا غير المهاجرة من السطح العلوي للغشاء، وتم تثبيت الخلايا التي هاجرت عبر غشاء المسام 8 ميكرومتر وتلطيخها باللون البنفسجي البلوري بنسبة 0.1 ٪. شريط المقياس، 50 ميكرومتر. ن = 3. 1. تمت إضافة الخلايا الصلبة أو الرخوة 4T1 أو MP -1 إلى الجزء العلوي من غرفة غزو ماتريجل لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. ثم أزيلت الخلايا غير الغازية من الجزء العلوي

Translated Description (French)

Article4 décembre 2020Open Access Source DataTransparent process Cell softness regulates tumorigenicity and stemness of cancer cells Jiadi Lv Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaThese authors contributed equal to this work Search for more papers by this author Yaoping Liu Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, ChinaThese authors contributed equal to this work Search for more papers by this author Feiran Cheng orcid.org/0000-0001-9460-9949 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaCes auteurs ont également contribué à ce travail Rechercher d'autres articles de cet auteur Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Yabo Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher plus d'articles de cet auteur Tianzhen Zhang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Nannan Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Cong Li Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Zhenfeng Wang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Longfei Ma Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Mengyu Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Qiang Zhu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher pour plus d'articles par cet auteur Xiaohan Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Recherche pour plus d'articles par cet auteur Ke Tang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Recherche pour plus d'articles par cet auteur Jingwei Ma Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Recherche pour plus d'articles par cet auteur Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jing Xie Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Yi Fang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Haizeng Zhang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Pékin, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Ning Wang Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA Rechercher d'autres articles de cet auteur Yuying Liu Auteur correspondant [email protected] orcid.org/0000-0003-2182-7210 Département d'immunologie et Laboratoire clé national de biologie moléculaire médicale, Institut des sciences médicales fondamentales, Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) et Peking Union Medical College, Pékin, Chine Centre d'immunologie clinique, CAMS, Pékin, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Bo Huang Correspondant Auteur [email protected] orcid.org/0000-0001-8476-1138 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Recherchez d'autres articles de cet auteur Jiadi Lv Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChineCes auteurs ont contribué de manière égale à ce travail Rechercher d'autres articles de cet auteur Yaoping Liu Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, ChineCes auteurs ont contribué de manière égale à ce travail Rechercher d'autres articles de cet auteur Feiran Cheng orcid.org/0000-0001-9460-9949 Département d'immunologie et Laboratoire clé national de biologie moléculaire médicale, Institut des sciences médicales fondamentales, Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChineCes auteurs ont contribué de manière égale à ce travail Rechercher d'autres articles de cet auteur Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Yabo Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Tianzhen Zhang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Nannan Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Cong Li Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Zhenfeng Wang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Sciences médicales, Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) et Peking Union Medical College, Pékin, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Longfei Ma Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) et Peking Union Medical College, Pékin, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Mengyu Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Qiang Zhu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Xiaohan Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, Chine Rechercher d'autres articles de cet auteur Ke Tang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jingwei Ma Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jing Xie Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Rechercher d'autres articles par cet auteur Yi Fang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Rechercher d'autres articles par cet auteur Haizeng Zhang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Rechercher d'autres articles par cet auteur Ning Wang Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA Rechercher d'autres articles par cet auteur Yuying Liu Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0003-2182-7210 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Bo Huang Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0001-8476-1138 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Rechercher d'autres articles de cet auteur Informations sur l'auteur Jiadi Lv1, Yaoping Liu2, Feiran Cheng1, Jiping Li3, Yabo Zhou1, Tianzhen Zhang1, Nannan Zhou1, Cong Li1, Zhenfeng Wang1, Longfei Ma1, Mengyu Liu1, Qiang Zhu1, Xiaohan Liu1, Ke Tang4, Jingwei Ma4, Huafeng Zhang4, Jing Xie1, Yi Fang5, Haizeng Zhang5, Ning Wang6, Yuying Liu *,1,7 et Bo Huang * ,1,4,7 1Département d'immunologie et Laboratoire clé national de biologie moléculaire médicale, Institut des sciences médicales fondamentales, Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China 2Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, China 3Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China 4Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China 5National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China 6Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA 7Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China *Auteur correspondant. Tél : +86 10 69156447 ; E-mail : [email protected] *Auteur correspondant. Tél : 86 10 69156464 ; E-mail : [email protected] EMBO J (2021)40 : e106123https://doi.org/10.15252/embj.2020106123 PDFTélécharger PDF du texte de l'article et des figures principales. Examen par les pairsTéléchargez un résumé du processus de décision éditoriale, y compris les lettres de décision éditoriale, les commentaires des évaluateurs et les réponses des auteurs aux commentaires. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Identifier et trier les cellules tumorales hautement tumorigènes et métastatiques à partir d'une population cellulaire hétérogène est un défi de taille. Ici, nous montrons que les dispositifs microfluidiques peuvent être utilisés pour trier les cellules souches cancéreuses hétérogènes (CSC) à base de marqueurs en sous-populations mécaniquement rigides et molles. Les cellules tumorales molles isolées (< 400 Pa) mais pas les cellules rigides (> 700 Pa) peuvent former une tumeur chez les souris immunocompétentes avec 100 cellules par inoculation. Notamment, seules les cellules molles, mais pas les cellules rigides, isolées à partir de CD133+, ALDH+ ou de CSC de population latérale, sont capables de former une tumeur avec seulement 100 cellules chez les souris NOD-SCID ou immunocompétentes. La protéine de signalisation Wnt BCL9L est régulée à la hausse dans les cellules tumorales molles et régule leur origine et leur tumorigénicité. Cliniquement, l'expression de BCL9L est corrélée à un pronostic plus défavorable. Nos résultats suggèrent que la douceur intrinsèque est un marqueur unique des cellules tumorales hautement tumorigènes et métastatiques. Synopsis La rigidité cellulaire a été associée à des propriétés semblables à celles des cellules souches au cours du développement et du cancer. Ici, la douceur mécanique associée à une expression élevée du régulateur transcriptionnel BCL9L est identifiée comme un marqueur général des cellules souches cancéreuses. Le tri microfluidique permet de séparer les cellules tumorales en fonction de leur rigidité mécanique. Les cellules tumorales molles présentent une tumorigénicité accrue in vivo. BCL9L est un régulateur de la souche dans les cellules tumorales molles. Les taux de BCL9L et la douceur des cellules tumorales sont en corrélation avec la progression de la maladie chez les patients atteints de mélanome, de cancer du sein et du côlon. Introduction La notion de « cellules souches cancéreuses » ou cellules tumorigènes a été basée sur l'observation que seule une très petite population de cellules d'une tumeur peut ensemencer et former une tumeur chez des souris immunodéficientes combinées sévères (SCID) (Lapidot et al, 1994 ; Al-Hajj et al, 2003 ; Hope et al, 2004 ; Singh et al, 2004 ; O'Brien et al, 2007 ; Quintana et al, 2008 ; Schatton et al, 2008). Ces cellules tumorigènes sont considérées comme la source de la résistance au traitement et de la rechute d'une tumeur, ce qui en fait une cible thérapeutique tentante. Cependant, malgré des études intensives, les propriétés de ce sous-ensemble crucial de cellules tumorales restent mal comprises. De plus, des méthodes rigoureuses ne sont pas disponibles pour isoler ces cellules d'une tumeur, car les marqueurs de surface cellulaires conventionnels sont peu fiables et très variables entre les différents cancers (Hope et al, 2004 ; Dieter Sebastian et al, 2011). Ainsi, le développement d'une méthode capable de trier et de définir efficacement les cellules tumorigènes est extrêmement souhaitable. Les rapports publiés ont mis en évidence l'importance des propriétés mécaniques d'une cellule vivante dans les comportements et les fonctions cellulaires (Engler et al, 2006 ; Chowdhury et al, 2010 ; Urbanska et al, 2017). On sait que les cellules appliquent des forces contractiles dépendantes de l'actomyosine en réponse à la rigidité croissante des matrices extracellulaires (ECM) (Discher et al, 2005 ; Irianto et al, 2016). Une telle contraction endogène, à son tour, peut augmenter la rigidité cellulaire (Wang et al, 1993). De plus, pour bien détecter et répondre aux signaux mécaniques environnants, la rigidité d'une cellule doit correspondre à celle des ECM (Discher et al, 2005 ; Discher et al, 2009 ; Wu et al, 2018), ce qui suggère que les cellules molles devraient survivre dans un stroma mou et que les cellules rigides se comportent de manière optimale dans une niche rigide. En guise de support, nous avons démontré que les matrices de fibrine molle 3D favorisent la déméthylation de H3K9 et augmentent l'expression de SOx2 et l'auto-renouvellement des cellules souches de mélanome, alors que les cellules rigides exercent des effets opposés (Tan et al, 2014). Conformément à cette notion, des cellules présentant différents degrés de rigidité peuvent coexister au sein d'un même tissu tumoral, en raison de l'hétérogénéité des micro-environnements mécaniques tumoraux (Plodinec et al, 2012 ; Elosegui-Artola et al, 2014). Malgré cette compréhension, la preuve directe que la douceur cellulaire fonctionne comme une caractéristique de base pour les cellules tumorigènes reste insaisissable. Dans cette étude, nous développons une méthode pour séparer les cellules molles des cellules rigides et fournissons la preuve que ces cellules molles sont hautement tumorigènes et possèdent la capacité de métastaser. Résultats Les cellules tumorales molles sont triées par puce microfluidique En effet, l'analyse par microscopie à force atomique (AFM) a montré que la rigidité des cellules tumorales dans le cancer du sein de la souris (4T1), le cancer du sein humain (MCF-7), le mélanome B16 de la souris et le mélanome humain primitif (MP-1) était très variable, allant de 0,2 à 1,3 kPa. Notamment, plus de 60 % des cellules tumorales avaient au moins une rigidité de 0,7 kPa et moins de 10 % des cellules tumorales avaient une rigidité inférieure à 0,4 kPa (Fig EV1A). Puisque la douceur (l'inverse de la rigidité) rend une cellule plus déformable, nous avons donc rationnellement exploré cela comme un moyen de séparer les cellules tumorales molles des cellules rigides (Mohamed et al, 2009 ; Zhang et al, 2012). Cliquez ici pour développer ce chiffre. Figure EV1. Les cellules tumorales molles sont isolées par puce microfluidique. La rigidité cellulaire de 4T1, MCF-7, B16F1 ou MP-1 a été détectée par AFM. n = 100. L'illustration schématique de la fabrication de puces microfluidiques PDMS pour quatre types différents. Plus le grossissement du canal microfluidique indiqué est faible. Le nombre de cellules B16 molles isolées à partir de quatre puces microfluidiques différentes au même flux de 13 μl/min pendant 10 min (densité cellulaire, 1 × 104 cellules/ml). La taille des cellules rigides et molles séparées des cellules en vrac 4T1, MCF-7, B16 ou MP-1 a été mesurée. n = 10. Les cellules B16 en vrac, rigides ou molles ont été cultivées dans une plaque à 6 puits pendant les périodes indiquées. Les cellules 4T1 molles et rigides ont été isolées par puce microfluidique (avant) puis mélangées pour être à nouveau séparées par puce microfluidique (après). La rigidité des cellules 4T1 avant et après re-séparation a été détectée par AFM. n = 100. La rigidité des cellules 4T1, MCF-7, B16 et MP-1 traitées par Cyto (5 μM) ou Jas (50 nM) pendant 4 h ou 12 h a été mesurée par AFM. n = 100. Les cellules tumorales molles ont été isolées par puce microfluidique à partir de cellules B16 ou MP-1 prétraitées par Cyto (5 μM) ou Jas (50 nM) pendant 4 h ou 12 h. Le nombre de cellules tumorales molles a été compté. n = 3. Informations sur les données : N.S., pas de différence significative. Test de Kruskal–Wallis (G), test de Bonferroni (C, D et H). Les données représentent la moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. Télécharger la figure Télécharger PowerPoint Ici, nous avons conçu une puce microfluidique unique pour le tri de cellules sans étiquette en fonction des caractéristiques physiques des cellules (par exemple, rigidité/déformabilité). Le dispositif microfluidique proposé se compose de deux composants principaux, des canaux d'écoulement et des structures de micro-air (figure 1A, supérieure). L'espace entre le micro-ondes et le canal principal peut agir comme une barrière passive et sélective pour isoler les cellules avec une variété de rigidité (Fig 1A, plus bas). Considérant que les cellules tumorales ont généralement une taille d'environ 20–25 μm (Hosokawa et al, 2010 ; Hvichia et al, 2016), dans cette étude, les puces microfluidiques ont été fabriquées avec une génération d'espace de 15 μm en réglant la hauteur du microfiltre et des canaux d'écoulement à 25 et 40 μm, respectivement. Selon les littératures précédentes (Mohamed et al, 2009 ; Zhang et al, 2012), quatre types différents de puces (avec des longueurs, des largeurs de structure de micropointes différentes, des espaces entre les structures de micropointes et le nombre total de structures de micropointes, illustrés sur la figure EV1B et le tableau EV1) ont été conçus et testés pour effectuer le tri. Des cellules (densité allant de 1 × 104 à 2 × 104/ml) avec différents degrés de rigidité ont été injectées dans la puce via une pompe à seringue à un flux de 10 μl/min (Fig 1B). Les cellules, lorsqu'elles sortaient de la sortie, étaient collectées sous forme de cellules molles. De plus, nous avons également pompé les cellules tumorales en vrac à travers les canaux microfluidiques avec un espace plus grand (18 μm) et avons lavé les canaux à l'inverse. Les cellules se sont ensuite écoulées par l'entrée de refoulement et ont été collectées sous forme de cellules rigides (Fig. 1B). Pour vérifier que ces cellules séparées sont authentiquement molles ou rigides, nous avons utilisé l'AFM pour mesurer la rigidité des cellules. En effet, les cellules qui sortaient de la sortie de chaque type de microtube étaient beaucoup plus douces que les cellules qui sortaient de l'entrée (Fig 1C). Notamment, le tube microfluidique n °2 (distance de 260 μm entre les crêtes et longueur de canal de 11,44 mm) a affiché la plus grande efficacité de tri (Fig EV1C) et a donc été utilisé pour les expériences suivantes. Les cellules tumorales isolées du mélanome (B16F1 et MP-1) et du cancer du sein (4T1 et MCF-7) par le tube microfluidique présentaient toutes le trait mou (Fig 1D). Nous avons constaté que les cellules rigides et molles séparées avaient une taille cellulaire similaire (Fig EV1D). En outre, les cellules tumorales rigides et molles présentaient une courbe de croissance similaire en culture in vitro (Fig EV1E). Étant donné que la rigidité des cellules tumorales molles isolées était inférieure à 0,4 kPa et que la rigidité des cellules rigides était supérieure à 0,65 kPa, nous avons défini les cellules molles comme celles ayant une rigidité < 0,4 kPa et les cellules rigides comme celles ayant une rigidité > 0,7 kPa dans cette étude. De plus, nous avons mélangé les cellules isolées molles et rigides pour la reséparation à l'aide de la puce microfluidique. Nous avons constaté que la distribution des cellules molles avant la re-séparation était tout à fait cohérente avec celles qui ont suivi la re-séparation (Fig EV1F), ce qui indique que ce tube microfluidique ne modifie pas la rigidité initiale des cellules. La F-actine est un élément essentiel qui contribue à la rigidité cellulaire (Wang et al, 1993). La cytochalasine D (Cyto), un inhibiteur de la polymérisation de l'actine, peut diminuer la rigidité cellulaire ; En revanche, le jasplakinolide (Jas), un cyclodepsipeptide naturel qui est un puissant inducteur de la polymérisation de l'actine, peut augmenter la rigidité cellulaire (Fig EV1G). Après le traitement Cyto ou Jas des cellules tumorales (4T1, MCF-7, B16 ou MP-1), le nombre de cellules tumorales molles de la sortie a été augmenté par Cyto mais diminué par Jas (Figures 1E et EV1H). Ainsi, une population marginale de cellules tumorales ayant la propriété mécanique de douceur peut être séparée des cellules en vrac à l'aide de la puce microfluidique. Figure 1. Les cellules tumorales molles sont triées par puce microfluidique Schéma de la puce microfluidique. Schéma de principe de fonctionnement pour le criblage cellulaire basé sur les différences de rigidité. L'efficacité de criblage de quatre types différents de puces a été détectée dans les cellules 4T1. n = 100. La rigidité des cellules filtrées à partir de la sortie ou de l'entrée de refoulement a été mesurée par AFM. n = 100. Le nombre de cellules molles 4T1 ou MCF-7 provenant de la sortie a été calculé après traitement avec ou sans Cyto (5 μM) ou Jas (50 nM) pendant 4 h ou 12 h, respectivement. Informations sur les données : test de Mann–Whitney (D), test de Kruskal–Wallis (C) ou ANOVA unidirectionnelle (E). Les données représentent la moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. Télécharger la figure Télécharger PowerPoint Les cellules molles sont hautement tumorigènes et métastatiques Ensuite, nous avons étudié la propriété biologique des cellules tumorales molles. Nos études précédentes avaient démontré que les cellules tumorigènes plutôt que les cellules tumorales différenciées sont sélectionnées et se développent dans des gels de fibrine 3D molles de 90 Pa (Liu et al, 2012 ; Liu et al, 2018) ; et ces cellules sélectionnées sont physiquement beaucoup plus molles que les homologues différenciées et peuvent être représentées par des cellules de mélanome CD133hi ou des cellules de cancer du sein ALDH+ in vivo (Liu et al, 2018). Ces résultats nous ont incités à émettre l'hypothèse que la douceur mécanique pourrait être une caractéristique commune aux cellules tumorigènes. Pour tester cette hypothèse, nous avons ensemencé les cellules tumorales molles ou rigides après séparation par un canal microfluidique (B16, MP-1, 4T1, MCF-7) dans les gels de fibrine 3D molle de 90 Pa. Nous avons constaté que plus de 95 % des cellules tumorales molles pouvaient former des colonies, tandis que les cellules tumorales rigides ne formaient que quelques colonies de taille beaucoup plus petite (Figures 2A et EV2A). Pendant ce temps, nous avons constaté que la douceur des cellules MCF-7 molles isolées pouvait être conservée dans des gels de fibrine molle, tandis que les cellules molles, si elles étaient ensemencées dans des plaques de culture rigides pendant 4 h, commençaient à devenir raides et atteignaient le pic raide 12 h plus tard. Ensuite, nous avons injecté 100 cellules molles ou rigides séparées (4T1 et MCF-7) dans les coussinets adipeux mammaires de souris NOD/SCID IL-2Rγ-null (NSG). Douze semaines plus tard, les 100 cellules molles pouvaient former une tumeur in situ avec une fréquence relativement élevée (6/10 pour 4T1, 4/10 pour MCF-7), tandis que les 100 cellules rigides injectées ne formaient pas de tumeur (Fig 2B). De plus, 100 cellules 4T1 molles pourraient même former une tumeur chez des souris immunocompétentes (BALB/c de type sauvage) avec un taux de formation tumorale (3/8), suggérant que les cellules tumorales molles ont une capacité hautement tumorigène. De plus, lorsque nous avons effectué des expériences de dilution limitante pour quantifier la fréquence des tumeurs pour chaque condition d'inoculation de cellules molles ou rigides (O'Brien et al, 2007), nous avons constaté que la fréquence la plus élevée de formation de tumeurs se produisait dans le groupe des cellules molles (Fig 2C). De plus, en effectuant des greffes en série avec 100 cellules tumorales molles, nous avons constaté que la taille et l'apparence de la première implantation étaient similaires à celles des deuxième et troisième générations de tumeurs passées chez les souris (figures 2D et EV2D). Une caractéristique cardinale du mélanome malin est son inclination à métastaser dans les poumons. Huit semaines après une injection intraveineuse de 100 cellules molles ou rigides séparées de B16-F1 ou MP-1 chez des souris NSG, des tumeurs métastatiques dans les poumons étaient visibles à partir du groupe de cellules molles. Fait intéressant, même aussi peu que 10 cellules molles pourraient générer des tumeurs métastatiques (2/12 pour B16 ou 2/8 pour MP-1), mais aucune tumeur métastatique n'a été détectée dans les poumons après l'injection de 100 cellules rigides (Fig 2E et F). Ensuite, nous avons utilisé le modèle de métastases pulmonaires à cellules 4T1 pour valider davantage ce résultat. Les cellules 4T1 molles ou rigides ont été injectées dans les coussinets adipeux mammaires de souris WT BALB/c. Huit semaines plus tard, les souris ont été sacrifiées pour la coloration H&E des poumons, montrant des tumeurs métastatiques (4/8) dans le groupe des cellules molles (Fig EV2E et F). Cependant, aucune tumeur métastatique pulmonaire (0/8) n'a été observée dans le groupe des cellules raides. Conformément à ces résultats in vivo, les cellules tumorales molles ont montré une plus grande capacité à migrer et à envahir in vitro, par rapport aux cellules rigides (Fig EV2G–I). Ensemble, ces données suggèrent que les cellules tumorales molles sont hautement tumorigènes dans leur capacité à former une tumeur à la fois sur les sites primaires et métastatiques. Figure 2. Les cellules tumorales molles ont la capacité de former des tumeurs chez la souris Des cellules molles ou rigides 4T1 ou MCF-7 ont été isolées par la puce microfluidique, puis ensemencées (500 cellules) dans un gel de fibrine 3D molle de 90 Pa pendant 3 jours. Le pourcentage de colonies formées a été calculé et la taille de la colonie a été enregistrée. Barre d'échelle, 100 μm. Les cellules 4T1 ou MCF-7 molles ou rigides (100 cellules) ont été injectées dans les coussinets adipeux mammaires de souris NSG ou BALB/c. Douze semaines plus tard, la formation de la tumeur a été enregistrée. n = 8–10. Identique à (B), sauf qu'un nombre différent de cellules 4T1 a été injecté dans les souris BALB/c. n = 10. La capacité de formation de tumeurs à partir des xénogreffes primaires (F1) et des tumeurs est passée aux receveurs secondaires (F2) et tertiaires (F3) induite par l'injection de 100 cellules molles 4T1 ou B16 dans les souris BALB/c ou C57BL/6. n = 10. Des cellules B16 ou MP-1 rigides ou molles (100 ou 10 cellules) ont été injectées aux souris NSG par voile de queue. n = 8–12. Des souris NSG ont été injectées par voie intraveineuse avec 100 cellules B16 ou MP-1 molles ou rigides. Huit semaines plus tard, la métastase pulmonaire a été analysée par coloration H&E. L'indice de métastase a été défini comme le pourcentage de la surface totale des nodules métastatiques par rapport à la surface totale des poumons sur la base du calcul à partir de 10 lames. Barre d'échelle, 0,5 mm n = 3 (pour B16) ou 5 (pour MP-1) souris avec tumeur métastatique. Informations sur les données : Test t de l'étudiant apparié à deux queues (A et F). Les données représentent la moyenne ± ET. n = 3 expériences indépendantes en (A). Télécharger la figure Télécharger PowerPoint Cliquez ici pour développer cette figure. Figure EV2. Les cellules tumorales molles ont une plus grande capacité à migrer et à envahir par rapport aux cellules rigides A. Les cellules B16 ou MP-1 rigides ou molles ont été isolées par puce microfluidique, puis 500 cellules molles ou rigides ont été ensemencées dans un gel de fibrine 3D molle de 90 Pa pendant 3 jours. Le pourcentage de formation de colonies a été calculé et la taille de la colonie a été enregistrée. Barre d'échelle, 100 μm. n = 3 pour le nombre de colonies et 10 pour la taille des colonies. B, C. Des cellules molles MCF-7 isolées par la puce microfluidique ont été cultivées dans un gel de fibrine 3D souple (B) ou un flacon rigide (C) pendant 4, 6, 12, 24, 48, 72 et 96 h. La rigidité des cellules a été déterminée par AFM. n = 100. D. La capacité de formation de tumeurs à partir des xénogreffes primaires (F1) et des tumeurs transmises aux receveurs secondaires (F2) et tertiaires (F3) induite par l'injection de 100 cellules molles MCF-7 ou MP-1 dans des souris NSG. n = 10. 100 cellules 4T1 rigides ou molles ont été injectées dans les coussinets adipeux mammaires de souris BALB/c (E) ou NSG (F) (n = 8). Huit semaines plus tard, la métastase pulmonaire a été comptée (E) et analysée par coloration H&E (F), n = 6 souris avec tumeur métastatique. Barre d'échelle, 0,5 mm. G. Les cellules B16-F1, MP-1, 4T1 ou MCF-7 molles ou rigides ont été cultivées jusqu'à confluence. Ensuite, les cellules ont été rayées et la fermeture de la plaie a été enregistrée à 24 h par microscopie à contraste de phase. Des images représentatives de sont affichées. La fermeture de la plaie a été calculée à l'aide du logiciel ImageJ et exprimée en pourcentage de la zone rayée initiale. Barre d'échelle, 250 μm. n = 10. H. Les cellules 4T1, MCF-7, B16-F1 ou MP-1 rigides ou molles ont été ajoutées dans l'insert de suspension pendant 24 h (4T1) ou 48 h (MCF-7, B16-F1 ou MP-1). Ensuite, les cellules non-migrantes ont été retirées de la surface supérieure de la membrane, et les cellules qui ont migré à travers la membrane poreuse de 8 µm ont été fixées et colorées avec 0,1% de cristal violet. Barre d'échelle, 50 μm. n = 3. I. Les cellules 4T1 ou MP-1 rigides ou molles ont été ajoutées au sommet d'une chambre d'invasion matrigel pendant 24 h ou 48 h. Ensuite, les cellules non invasives ont été retirées de la partie supérieure

Translated Description (Spanish)

Artículo4 de diciembre de 2020Fuente de datos de acceso abiertoProceso transparente La suavidad celular regula la tumorigenicidad y la capacidad de crecimiento de las células cancerosas Departamento de Inmunología Jiadi Lv y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Colegio Médico de la Unión de Pekín, Pekín, ChinaEstos autores contribuyeron por igual a este trabajo Buscar más artículos de este autor Instituto de Microelectrónica Yaoping Liu, Universidad de Pekín, Pekín, ChinaEstos autores contribuyeron por igual a este trabajo Buscar más artículos de este autor Feiran Cheng orcid.org/0000-0001-9460-9949 Departamento de Inmunología y National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, ChinaEstos autores contribuyeron igualmente a este trabajo Buscar más artículos de este autor Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Yabo Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Tianzhen Zhang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Nannan Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Cong Li Department of Immunology & National Key Laboratorio de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Colegio Médico de la Unión de Pekín, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Departamento de Inmunología de Zhenfeng Wang y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Colegio Médico de la Unión de Pekín, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Departamento de Inmunología de Longfei Ma y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Mengyu Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Qiang Zhu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar para más artículos de este autor Xiaohan Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Ke Tang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Buscar más artículos de este autor Jingwei Ma Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Buscar más artículos de este autor Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Search for more papers by this author Jing Xie Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Search for more papers by this author Yi Fang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Haizeng Zhang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Ning Wang Deaprrtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU. Buscar más artículos de este autor Yuying Liu Autor correspondiente [email protected] orcid.org/0000-0003-2182-7210 Departamento de Inmunología y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Peking Union Medical College, Beijing, Centro de Inmunología Clínica de China, CAMS, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Bo Huang Correspondiente Author [email protected] orcid.org/0000-0001-8476-1138 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Jiadi Lv Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) y Peking Union Medical College, Beijing, ChinaEstos autores contribuyeron por igual a este trabajo Búsqueda de más artículos de este autor Instituto Yaoping Liu de Microelectrónica, Universidad de Pekín, Beijing, ChinaEstos autores contribuyeron por igual a este trabajo Búsqueda de más artículos de este autor Feiran Cheng orcid.org/0000-0001-9460-9949 Departamento de Inmunología y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Peking Union Medical College, Beijing, ChinaEstos autores contribuyeron por igual a este trabajo Búsqueda de más artículos de este autor Jiping Li Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Departamento de Inmunología de Yabo Zhou y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Colegio Médico de la Unión de Pekín, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Departamento de Inmunología de Tianzhen Zhang y Laboratorio Nacional Clave de Biología Molecular Médica, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Colegio Médico de la Unión de Pekín, Beijing, China Buscar más artículos por este autor Nannan Zhou Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Cong Li Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Zhenfeng Wang Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Longfei Ma Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Mengyu Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Qiang Zhu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Xiaohan Liu Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Ke Tang Department of Biochemistry & Molecular Biología, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Busca más artículos de este autor Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Busca más artículos de este autor Huafeng Zhang Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Busca más artículos de este autor Jing Xie Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) y Peking Union Medical College, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Yi Fang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Haizeng Zhang National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Ning Wang Deaprrtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU. Buscar más artículos de este autor Yuying Liu Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0003-2182-7210 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Search for more papers by this author Bo Huang Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0001-8476-1138 Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China Buscar más artículos de este autor Author Information Jiadi LV1, Yaoping Liu2, Feiran Cheng1, Jiping Li3, Yabo Zhou1, Tianzhen Zhang1, Nannan Zhou1, Cong Li1, Zhenfeng Wang1, Longfei Ma1, Mengyu Liu1, Qiang Zhu1, Xiaohan Liu1, Ke Tang4, Jingwei Ma4, Huafeng Zhang4, Jing Xie1, Yi Fang5, Haizeng Zhang5, Ning Wang6, Yuying Liu * ,1,7 and Bo Huang * ,1,4,7 1Department of Immunology & National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College, Beijing, China 2Institute of Microelectronics, Peking University, Beijing, China 3Beijing Smartchip Microelectronics Technology Company Limited, Beijing, China 4Department of Biochemistry & Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, China 5National Cancer Center/Cancer Hospital, CAMS, Beijing, China 6Deaprtment of Mechanical Science and Technology, The Grainger College of Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, usa 7Clinical Immunology Center, CAMS, Beijing, China *Autor correspondiente. Tel: +86 10 69156447; Correo electrónico: [email protected] *Autor correspondiente. Tel: 86 10 69156464; E-mail: [email protected] EMBO J (2021)40: e106123https://doi.org/10.15252/embj.2020106123PDFDescargar PDF del texto del artículo y las figuras principales. Revisión por pares: descargue un resumen del proceso de decisión editorial, incluidas las cartas de decisión editorial, los comentarios del revisor y las respuestas del autor a los comentarios. HerramientasAñadir a favoritosDescargar citasCitas de seguimientoPermisos CompartirFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Identificar y clasificar células tumorales altamente tumorigénicas y metastásicas de una población celular heterogénea es un desafío abrumador. Aquí, mostramos que los dispositivos microfluídicos se pueden usar para clasificar las células madre cancerosas heterogéneas (CSC) basadas en marcadores en subpoblaciones mecánicamente rígidas y blandas. Las células tumorales blandas aisladas (< 400 Pa) pero no las rígidas (> 700 Pa) pueden formar un tumor en ratones inmunocompetentes con 100 células por inoculación. En particular, solo las células blandas, pero no las rígidas, aisladas de CD133+, ALDH+ o CSC de población lateral, son capaces de formar un tumor con solo 100 células en ratones NOD-SCID o inmunocompetentes. La proteína de señalización de Wnt BCL9L está regulada positivamente en las células tumorales blandas y regula su tallo y tumorigenicidad. Clínicamente, la expresión de BCL9L se correlaciona con un peor pronóstico. Nuestros hallazgos sugieren que la suavidad intrínseca es un marcador único de células tumorales altamente tumorigénicas y metastásicas. Sinopsis La rigidez celular se ha asociado con propiedades similares a las células madre en el desarrollo y el cáncer. Aquí, la suavidad mecánica asociada con la alta expresión del regulador transcripcional BCL9L se identifica como un marcador general de células madre cancerosas. La clasificación microfluídica permite la separación de las células tumorales según su rigidez mecánica. Las células tumorales blandas muestran una mayor tumorigenicidad in vivo. BCL9L es un regulador de la madreidad en las células tumorales blandas. Los niveles de BCL9L y la suavidad de las células tumorales se correlacionan con la progresión de la enfermedad en pacientes con melanoma, cáncer de mama y de colon. Introducción La noción de "células madre cancerosas" o células tumorigénicas se ha basado en la observación de que solo una población muy pequeña de células de un tumor puede sembrar y formar un tumor en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) (Lapidot et al, 1994; Al-Hajj et al, 2003; Hope et al, 2004; Singh et al, 2004; O'Brien et al, 2007; Quintana et al, 2008; Schatton et al, 2008). Estas células tumorigénicas se consideran la fuente de la resistencia al tratamiento y la recaída de un tumor, lo que las convierte en un objetivo terapéutico tentador. Sin embargo, a pesar de los estudios intensivos, las propiedades de este subconjunto crucial de células tumorales siguen siendo poco conocidas. Además, no se dispone de métodos rigurosos para aislar estas células de un tumor, porque los marcadores convencionales de la superficie celular no son fiables y son muy variables entre los diferentes cánceres (Hope et al, 2004; Dieter Sebastian et al, 2011). Por lo tanto, es extremadamente deseable desarrollar un método que pueda clasificar y definir eficazmente las células tumorigénicas. Los informes publicados han destacado la importancia de las propiedades mecánicas de una célula viva en los comportamientos y funciones celulares (Engler et al, 2006; Chowdhury et al, 2010; Urbanska et al, 2017). Se sabe que las células aplican fuerzas contráctiles dependientes de actomiosina en respuesta a la creciente rigidez de las matrices extracelulares (ECM) (Discher et al, 2005; Irianto et al, 2016). Dicha contracción endógena, a su vez, puede elevar la rigidez celular (Wang et al, 1993). Además, para detectar y responder adecuadamente a las señales mecánicas circundantes, la rigidez de una célula debe coincidir con la de las ECM (Discher et al, 2005; Discher et al, 2009; Wu et al, 2018), lo que sugiere que las células blandas deben sobrevivir en un estroma blando y las células rígidas se comportan de manera óptima en un nicho rígido. Como apoyo, hemos demostrado que las matrices de fibrina blanda 3D promueven la desmetilación de H3K9 y aumentan la expresión de Sox2 y la autorrenovación de las células madre de melanoma, mientras que las rígidas ejercen efectos opuestos (Tan et al, 2014). En línea con esta noción, las células con diversos grados de rigidez pueden coexistir dentro del mismo tejido tumoral, debido a la heterogeneidad de los microambientes mecánicos tumorales (Plodinec et al, 2012; Elosegui-Artola et al, 2014). A pesar de tal comprensión, la evidencia directa de que la suavidad celular funciona como una característica básica para las células tumorigénicas sigue siendo difícil de alcanzar. En este estudio, desarrollamos un método para separar las células blandas de las rígidas y proporcionar evidencia de que estas células blandas son altamente tumorigénicas y poseen la capacidad de hacer metástasis. Resultados Las células tumorales blandas se clasifican por chip microfluídico De hecho, el análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM) mostró que la rigidez de las células tumorales en el cáncer de mama de ratón (4T1), el cáncer de mama humano (MCF-7), el melanoma B16 de ratón y el melanoma humano primario (MP-1) fue muy variable, variando de 0,2 a 1,3 kPa. En particular, más del 60% de las células tumorales tenían al menos una rigidez de 0,7 kPa y menos del 10% de las células tumorales tenían una rigidez inferior a 0,4 kPa (Fig. EV1A). Dado que la blandura (la inversa de la rigidez) hace que una célula tenga un mayor grado de deformabilidad, exploramos racionalmente esto como una forma de separar las células tumorales blandas de las rígidas (Mohamed et al, 2009; Zhang et al, 2012). Haga clic aquí para expandir esta figura. Figura EV1. Las células tumorales blandas se aíslan mediante chip microfluídico. La rigidez celular de 4T1, MCF-7, B16F1 o MP-1 se detectó mediante AFM. n = 100. La ilustración esquemática de la fabricación de chips microfluídicos PDMS para cuatro tipos diferentes. El menor es el aumento del canal microfluídico indicado. El número de células B16 blandas aisladas de cuatro chips microfluídicos diferentes al mismo flujo de 13 μl/min durante 10 min (densidad celular, 1 × 104 células/ml). Se midió el tamaño de las células rígidas y blandas separadas de las células a granel 4T1, MCF-7, B16 o MP-1. n = 10. Las células B16 a granel, rígidas o blandas se cultivaron en una placa de 6 pocillos durante los períodos de tiempo indicados. Las células 4T1 blandas y rígidas se aislaron mediante chip microfluídico (antes) y luego se mezclaron para separarse nuevamente mediante chip microfluídico (después). La rigidez de las células 4T1 antes y después de la re-separación fue detectada por AFM. n = 100. La rigidez de las células 4T1, MCF-7, B16 y MP-1 tratadas con Cyto (5 μM) o Jas (50 nM) durante 4 h o 12 h se midió mediante AFM. n = 100. Las células tumorales blandas se aislaron mediante chip microfluídico de células B16 o MP-1 pretratadas con Cyto (5 μM) o Jas (50 nM) durante 4 h o 12 h. Se contó el número de células tumorales blandas. n = 3. Información de datos: N. S., ninguna diferencia significativa. Prueba de Kruskal–Wallis (G), prueba de Bonferroni (C, D y H). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. Descargar figura Descargar PowerPoint Aquí, diseñamos un chip microfluídico único para la clasificación de células sin etiqueta en función de las características físicas de las células (por ejemplo, rigidez/deformabilidad). El dispositivo microfluídico propuesto consta de dos componentes principales, canales de flujo y estructuras de microcircuito (Fig. 1A, superior). La brecha entre el microcircuito y el canal principal puede actuar como una barrera pasiva y selectiva para aislar células con una variedad de rigidez (Fig. 1A, inferior). Teniendo en cuenta que las células tumorales suelen tener un tamaño de alrededor de 20–25 μm (Hosokawa et al, 2010; Hvichia et al, 2016), en este estudio, los chips microfluídicos se fabricaron con una generación de brecha de 15 μm estableciendo la altura del microcircuito y los canales de flujo en 25 y 40 μm, respectivamente. De acuerdo con la bibliografía anterior (Mohamed et al, 2009; Zhang et al, 2012), se diseñaron y probaron cuatro tipos diferentes de chips (con diferentes longitudes, anchuras de la estructura del microcircuito, espacios entre las estructuras del microcircuito y el número total de estructuras del microcircuito, que se muestran en la Fig. EV1B y la Tabla EV1) para realizar la clasificación. Las células (densidad que varía de 1 × 104 a 2 × 104/ml) con diferente grado de rigidez se inyectaron en el chip a través de una bomba de jeringa a un flujo de 10 μl/min (Fig. 1B). Las células, a medida que fluían hacia fuera de la salida, se recogieron como células blandas. Además, también bombeamos las células tumorales a granel a través de los canales microfluídicos con un espacio más grande (18 μm) y lavamos inversamente los canales. Las células luego fluyeron hacia afuera desde la entrada de reflujo y se recogieron como células rígidas (Fig. 1B). Para verificar que estas células separadas son auténticamente blandas o rígidas, utilizamos AFM para medir la rigidez de las células. De hecho, las células que fluían desde la salida de cada tipo de microtubo eran mucho más blandas que las células que fluían desde la entrada (Fig. 1C). En particular, el tubo microfluídico n .º2 (distancia de 260 μm entre las crestas y una longitud de canal de 11,44 mm) mostró la mayor eficiencia de clasificación (Fig. EV1C) y, por lo tanto, se utilizó para los siguientes experimentos. Las células tumorales aisladas de melanoma (B16F1 y MP-1) y cáncer de mama (4T1 y MCF-7) por el tubo microfluídico mostraron el rasgo blando (Fig. 1D). Descubrimos que las células rígidas y blandas separadas tenían un tamaño celular similar (Fig. EV1D). Además, las células tumorales rígidas y blandas mostraron una curva de crecimiento similar en cultivo in vitro (Fig. EV1E). Dado que la rigidez de las células tumorales blandas aisladas era inferior a 0,4 kPa y la rigidez de las células rígidas era superior a 0,65 kPa, definimos las células blandas como aquellas con < 0,4 kPa de rigidez y las células rígidas como aquellas con > 0,7 kPa de rigidez en este estudio. Además, mezclamos las células blandas y rígidas aisladas para volver a separarlas utilizando el chip microfluídico. Encontramos que la distribución de las células blandas antes de la re-separación era completamente consistente con las que siguieron a la re-separación (Fig. EV1F), lo que indica que este tubo microfluídico no altera la rigidez original de las células. La actina F es un elemento esencial que contribuye a la rigidez celular (Wang et al, 1993). La citocalasina D (Cyto), un inhibidor de la polimerización de actina, puede disminuir la rigidez celular; en contraste, la jasplakinolida (Jas), un ciclodepsipéptido natural que es un potente inductor de la polimerización de actina, puede aumentar la rigidez celular (Fig. EV1G). Después del tratamiento con Cyto o Jas de las células tumorales (4T1, MCF-7, B16 o MP-1), el número de células tumorales blandas desde la salida aumentó en Cyto pero disminuyó en Jas (Figuras 1E y EV1H). Por lo tanto, se puede separar una población marginal de células tumorales con la propiedad mecánica de suavidad de las células a granel utilizando el chip microfluídico. Figura 1. Las células tumorales blandas se clasifican por chip microfluídico Esquema del chip microfluídico. Esquema del principio de funcionamiento para el cribado celular basado en las diferencias de rigidez. Se detectó la eficiencia de cribado de cuatro tipos diferentes de chip en células 4T1. n = 100. La rigidez de las células examinadas desde la salida o la entrada de reflujo se midió mediante AFM. n = 100. El número de células 4T1 o MCF-7 blandas de la salida se calculó después del tratamiento con o sin Cyto (5 μM) o Jas (50 nM) durante 4 h o 12 h, respectivamente. Información de datos: prueba de Mann–Whitney (D), prueba de Kruskal–Wallis (C) o ANOVA unidireccional (E). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. Figura de descarga Descargar PowerPoint Las células blandas son altamente tumorigénicas y metastásicas A continuación, investigamos la propiedad biológica de las células tumorales blandas. Nuestros estudios anteriores habían demostrado que las células tumorigénicas en lugar de las células tumorales diferenciadas se seleccionan y crecen en geles de fibrina 3D blandos de 90 Pa (Liu et al, 2012; Liu et al, 2018); y estas células seleccionadas son físicamente mucho más blandas que las contrapartes diferenciadas y pueden estar representadas por células de melanoma CD133hi o células de cáncer de mama ALDH+ in vivo (Liu et al, 2018). Estos hallazgos nos llevaron a plantear la hipótesis de que la suavidad mecánica podría ser una característica común de las células tumorigénicas. Para probar esta hipótesis, sembramos las células tumorales blandas o rígidas después de la separación por un canal microfluídico (B16, MP-1, 4T1, MCF-7) en los geles de fibrina 3D blandos de 90 Pa. Descubrimos que más del 95% de las células tumorales blandas podían formar colonias, mientras que las células tumorales rígidas solo formaban pocas colonias con un tamaño mucho más pequeño (Figuras 2A y EV2A). Mientras tanto, descubrimos que la blandura de las células MCF-7 blandas aisladas se podía mantener en geles de fibrina blandos, mientras que las células blandas, si se sembraban en placas de cultivo rígidas durante 4 h, comenzaban a volverse rígidas y alcanzaban el pico rígido 12 h más tarde. A continuación, inyectamos 100 células blandas o rígidas separadas (4T1 y MCF-7) en las almohadillas de grasa mamaria de ratones NOD/SCID IL-2Rγ-null (NSG). Doce semanas después, las 100 células blandas podrían formar un tumor in situ con una frecuencia relativamente alta (6/10 para 4T1, 4/10 para MCF-7), mientras que las 100 células rígidas inyectadas no formaron un tumor (Fig. 2B). Además, 100 células 4T1 blandas podrían incluso formar un tumor en ratones inmunocompetentes (BALB/c de tipo salvaje) con una tasa de formación tumoral (3/8), lo que sugiere que las células tumorales blandas tienen una capacidad altamente tumorigénica. Además, cuando realizamos experimentos de dilución limitante para cuantificar la frecuencia de tumores para cada condición de inoculación de células blandas o rígidas (O'Brien et al, 2007), encontramos que la mayor frecuencia de formación de tumores ocurrió en el grupo de células blandas (Fig. 2C). Además, al realizar trasplantes en serie con 100 células tumorales blandas, encontramos que el tamaño y la apariencia del tumor de la primera implantación fueron similares a los de la segunda y tercera generación de tumores sometidos a pases en los ratones (Figuras 2D y EV2D). Una característica cardinal del melanoma maligno es su inclinación a hacer metástasis a los pulmones. Ocho semanas después de una inyección intravenosa de 100 células blandas o rígidas separadas de B16-F1 o MP-1 en ratones NSG, los tumores metastásicos en los pulmones fueron visibles desde el grupo de células blandas. Curiosamente, incluso tan solo 10 células blandas podrían generar tumores metastásicos (2/12 para B16 o 2/8 para MP-1), pero no se detectaron tumores metastásicos en los pulmones después de la inyección de 100 células rígidas (Fig. 2E y F). Luego, utilizamos el modelo de metástasis pulmonar de células 4T1 para validar aún más este resultado. Las células 4T1 blandas o rígidas se inyectaron en las almohadillas de grasa mamaria de ratones WT BALB/c. Ocho semanas después, los ratones se sacrificaron para la tinción H&E de los pulmones, mostrando tumores metastásicos (4/8) en el grupo de células blandas (Fig. EV2E y F). Sin embargo, no se observaron tumores metastásicos pulmonares (0/8) en el grupo de células rígidas. En línea con estos resultados in vivo, las células tumorales blandas mostraron una mayor capacidad para migrar e invadir in vitro, en comparación con las células rígidas (Fig. EV2G–I). En conjunto, estos datos sugieren que las células tumorales blandas son altamente tumorigénicas en su capacidad para formar un tumor tanto en sitios primarios como metastásicos. Figura 2. Las células tumorales blandas tienen la capacidad de formar tumores en ratones. Las células 4T1 o MCF-7 blandas o rígidas se aislaron mediante el chip microfluídico y luego se sembraron (500 células) en gel de fibrina 3D blando de 90 Pa durante 3 días. Se calculó el porcentaje de colonias formadas y se registró el tamaño de la colonia. Barra de escala, 100 μm. Las células 4T1 o MCF-7 blandas o rígidas (100 células) se inyectaron en las almohadillas de grasa mamaria de ratones NSG o BALB/c. Doce semanas después, se registró la formación del tumor. n = 8–10. Lo mismo que (B), excepto que se inyectó un número diferente de células 4T1 en los ratones BALB/c. n = 10. La capacidad de formación de tumores a partir de xenoinjertos primarios (F1) y tumores pasados a receptores secundarios (F2) y terciarios (F3) inducida por la inyección de 100 células blandas 4T1 o B16 en los ratones BALB/c o C57BL/6. n = 10. Se inyectaron células B16 o MP-1 rígidas o blandas (100 o 10 células) en los ratones NSG mediante el velo de la cola. n = 8–12. Los ratones NSG se inyectaron por vía intravenosa con 100 células B16 o MP-1 blandas o rígidas. Ocho semanas después, se analizó la metástasis pulmonar mediante tinción H&E. El índice de metástasis se definió como el porcentaje del área total de nódulos metastásicos con respecto al área total de los pulmones según el cálculo de 10 portaobjetos. Barra de escala, 0.5 mm. n = 3 (para B16) o 5 (para MP-1) ratones con tumor metastásico. Información de datos: Prueba t de Student pareada de dos colas (A y F). Los datos representan la media ± SD. n = 3 experimentos independientes en (A). Figura de descarga Descargar PowerPoint Haga clic aquí para expandir esta figura. Figura EV2. Las células tumorales blandas tienen una mayor capacidad para migrar e invadir en comparación con las células rígidas A. Las células B16 o MP-1 rígidas o blandas se aislaron mediante chip microfluídico, y luego se sembraron 500 células blandas o rígidas en un gel de fibrina 3D blando de 90 Pa durante 3 días. Se calculó el porcentaje de formación de colonias y se registró el tamaño de la colonia. Barra de escala, 100 μm. n = 3 para el número de colonias y 10 para el tamaño de las colonias. B, C. Las células MCF-7 blandas aisladas por el chip microfluídico se cultivaron en gel de fibrina 3D blando (B) o matraz rígido (C) durante 4, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h. La rigidez de las células se determinó mediante AFM. n = 100. D. La capacidad de formación de tumores a partir de xenoinjertos primarios (F1) y tumores pasados a receptores secundarios (F2) y terciarios (F3) inducida por la inyección de 100 células blandas MCF-7 o MP-1 en ratones NSG. n = 10. E, F. Se inyectaron 100 células 4T1 rígidas o blandas en las almohadillas de grasa mamaria de ratones BALB/c (E) o NSG (F) (n = 8). Ocho semanas después, se contó la metástasis pulmonar (E) y se analizó mediante tinción H&E (F), n = 6 ratones con tumor metastásico. Barra de escala, 0,5 mm. G. Las células B16-F1, MP-1, 4T1 o MCF-7 blandas o rígidas se cultivaron hasta la confluencia. A continuación, se rascaron las células y se registró el cierre de la herida a las 24 h mediante microscopía de contraste de fases. Se muestran imágenes representativas de. El cierre de la herida se calculó utilizando el software ImageJ y se expresó como un porcentaje del área rayada inicial. Barra de escala, 250 μm. n = 10. H. Las células 4T1, MCF-7, B16-F1 o MP-1 rígidas o blandas se añadieron al inserto colgante durante 24 h (4T1) o 48 h (MCF-7, B16-F1 o MP-1). A continuación, las células no migratorias se retiraron de la superficie superior de la membrana y las células que migraron a través de la membrana de poro de 8 µm se fijaron y se tiñeron con violeta cristal al 0,1%. Barra de escala, 50 μm. n = 3. I. Las células 4T1 o MP-1 rígidas o blandas se añadieron a la parte superior de una cámara de invasión de matrigel durante 24 h o 48 h. A continuación, se retiraron las células no invasivas del sur superior

Files

embj.2020106123.pdf

Files (16.0 kB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:0125d8f44260baa2b82fd18202af5262
16.0 kB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تنظّم نعومة الخلايا تولد الأورام ونمو الخلايا السرطانية
Translated title (French)
La douceur cellulaire régule la tumorigénicité et la fragilité des cellules cancéreuses
Translated title (Spanish)
La blandura celular regula la tumorigenicidad y la capacidad de crecimiento de las células cancerosas

Identifiers

Other
https://openalex.org/W3109961441
DOI
10.15252/embj.2020106123

Is supplement to
https://openalex.org/W4302381976 (Other)
https://openalex.org/W4283831541 (Other)
https://openalex.org/W4243634448 (Other)
https://openalex.org/W4232219214 (Other)
https://openalex.org/W2979752698 (Other)
https://openalex.org/W2805185066 (Other)
https://openalex.org/W2531913951 (Other)
https://openalex.org/W2418239294 (Other)
https://openalex.org/W2186113122 (Other)
https://openalex.org/W1523310174 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
China

References

  • https://openalex.org/W1813089926
  • https://openalex.org/W1872124954
  • https://openalex.org/W1888700889
  • https://openalex.org/W1981401376
  • https://openalex.org/W1984633251
  • https://openalex.org/W1988397531
  • https://openalex.org/W1989095124
  • https://openalex.org/W1989958716
  • https://openalex.org/W1990757263
  • https://openalex.org/W1996152000
  • https://openalex.org/W1998196049
  • https://openalex.org/W2001544973
  • https://openalex.org/W2006073003
  • https://openalex.org/W2020131167
  • https://openalex.org/W2022746045
  • https://openalex.org/W2023316892
  • https://openalex.org/W2023427658
  • https://openalex.org/W2024315189
  • https://openalex.org/W2033363278
  • https://openalex.org/W2036876826
  • https://openalex.org/W2043772256
  • https://openalex.org/W2043999650
  • https://openalex.org/W2048385227
  • https://openalex.org/W2051055358
  • https://openalex.org/W2051870121
  • https://openalex.org/W2052766715
  • https://openalex.org/W2054449135
  • https://openalex.org/W2054635074
  • https://openalex.org/W2060932651
  • https://openalex.org/W2061143120
  • https://openalex.org/W2061869750
  • https://openalex.org/W2069518226
  • https://openalex.org/W2077036771
  • https://openalex.org/W2090982381
  • https://openalex.org/W2092412094
  • https://openalex.org/W2099052265
  • https://openalex.org/W2104666893
  • https://openalex.org/W2116413963
  • https://openalex.org/W2123130682
  • https://openalex.org/W2126326508
  • https://openalex.org/W2134208433
  • https://openalex.org/W2141384174
  • https://openalex.org/W2143425711
  • https://openalex.org/W2156365913
  • https://openalex.org/W2165673443
  • https://openalex.org/W2284393155
  • https://openalex.org/W2323751645
  • https://openalex.org/W2427836746
  • https://openalex.org/W2475195266
  • https://openalex.org/W2601574496
  • https://openalex.org/W2767849505
  • https://openalex.org/W2770583262
  • https://openalex.org/W2790897054
  • https://openalex.org/W2808157488
  • https://openalex.org/W2914936371
  • https://openalex.org/W2967707418
  • https://openalex.org/W604230466