Published July 16, 2010 | Version v1
Publication Open

Using quantitative real-time PCR to detect chimeras in transgenic tobacco and apricot and to monitor their dissociation

Creators

  • 1. Chouaib Doukkali University
  • 2. Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura

Description

Abstract Background The routine generation of transgenic plants involves analysis of transgene integration into the host genome by means of Southern blotting. However, this technique cannot distinguish between uniformly transformed tissues and the presence of a mixture of transgenic and non-transgenic cells in the same tissue. On the other hand, the use of reporter genes often fails to accurately detect chimerical tissues because their expression can be affected by several factors, including gene silencing and plant development. So, new approaches based on the quantification of the amount of the transgene are needed urgently. Results We show here that chimeras are a very frequent phenomenon observed after regenerating transgenic plants. Spatial and temporal analyses of transformed tobacco and apricot plants with a quantitative, real-time PCR amplification of the neomycin phosphotransferase ( npt II) transgene as well as of an internal control (β- actin ), used to normalise the amount of target DNA at each reaction, allowed detection of chimeras at unexpected rates. The amount of the npt II transgene differed greatly along with the sub-cultivation period of these plants and was dependent on the localisation of the analysed leaves; being higher in roots and basal leaves, while in the apical leaves it remained at lower levels. These data demonstrate that, unlike the use of the gus marker gene, real-time PCR is a powerful tool for detection of chimeras. Although some authors have proposed a consistent, positive Southern analysis as an alternative methodology for monitoring the dissociation of chimeras, our data show that it does not provide enough proof of uniform transformation. In this work, however, real-time PCR was applied successfully to monitor the dissociation of chimeras in tobacco plants and apricot callus. Conclusions We have developed a rapid and reliable method to detect and estimate the level of chimeras in transgenic tobacco and apricot plants. This method can be extended to monitor the dissociation of chimeras and the recovery of uniformly-transformed plants.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

نبذة مختصرة ينطوي التوليد الروتيني للنباتات المحورة وراثياً على تحليل تكامل الجينات المحورة في الجينوم المضيف عن طريق النشاف الجنوبي. ومع ذلك، لا يمكن لهذه التقنية التمييز بين الأنسجة المحولة بشكل موحد ووجود خليط من الخلايا المحورة وراثيا وغير المحورة وراثيا في نفس الأنسجة. من ناحية أخرى، غالبًا ما يفشل استخدام جينات المراسل في اكتشاف الأنسجة الوهمية بدقة لأن تعبيرها يمكن أن يتأثر بعدة عوامل، بما في ذلك إسكات الجينات وتطور النبات. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى مناهج جديدة تستند إلى القياس الكمي لكمية الجين المحول. النتائج نظهر هنا أن الكيميرا هي ظاهرة متكررة جدًا لوحظت بعد تجديد النباتات المعدلة وراثيًا. سمحت التحليلات المكانية والزمانية لنباتات التبغ والمشمش المحولة مع تضخيم PCR الكمي في الوقت الفعلي للجين المحول لنيوميسين فوسفوترانسفيراز ( NPT II) بالإضافة إلى التحكم الداخلي (β - أكتين )، المستخدم لتطبيع كمية الحمض النووي المستهدف في كل تفاعل، بالكشف عن الكميرات بمعدلات غير متوقعة. اختلفت كمية الجين المحول NPT II اختلافًا كبيرًا مع فترة الزراعة الفرعية لهذه النباتات وكانت تعتمد على توطين الأوراق التي تم تحليلها ؛ كونها أعلى في الجذور والأوراق القاعدية، بينما في الأوراق القمية بقيت عند مستويات أقل. تُظهر هذه البيانات أنه، على عكس استخدام جين علامة GUS، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي هو أداة قوية للكشف عن الوهم. على الرغم من أن بعض المؤلفين اقترحوا تحليلاً جنوبياً متسقاً وإيجابياً كمنهجية بديلة لرصد انفصال الكيميرا، إلا أن بياناتنا تظهر أنها لا تقدم دليلاً كافياً على التحول الموحد. ومع ذلك، في هذا العمل، تم تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بنجاح لمراقبة انفصال الكيميرا في نباتات التبغ ودشبذ المشمش. الاستنتاجات لقد طورنا طريقة سريعة وموثوقة لاكتشاف وتقدير مستوى الكيميرا في التبغ المعدل وراثيا ونباتات المشمش. يمكن تمديد هذه الطريقة لمراقبة تفكك الكميرات واستعادة النباتات التي تحولت بشكل موحد.

Translated Description (French)

Résumé Contexte La génération systématique de plantes transgéniques implique l'analyse de l'intégration transgénique dans le génome de l'hôte au moyen du Southern blot. Cependant, cette technique ne permet pas de faire la distinction entre les tissus uniformément transformés et la présence d'un mélange de cellules transgéniques et non transgéniques dans le même tissu. D'autre part, l'utilisation de gènes rapporteurs échoue souvent à détecter avec précision les tissus chimériques car leur expression peut être affectée par plusieurs facteurs, notamment le silençage des gènes et le développement des plantes. Ainsi, de nouvelles approches basées sur la quantification de la quantité de transgène sont nécessaires de toute urgence. Résultats Nous montrons ici que les chimères sont un phénomène très fréquent observé après la régénération des plantes transgéniques. Des analyses spatiales et temporelles de plants de tabac et d'abricot transformés avec une amplification PCR quantitative en temps réel du transgène néomycine phosphotransférase ( npt II) ainsi que d'un contrôle interne (β- actine ), utilisés pour normaliser la quantité d'ADN cible à chaque réaction, ont permis de détecter des chimères à des vitesses inattendues. La quantité du transgène NTP II différait considérablement avec la période de sous-culture de ces plantes et dépendait de la localisation des feuilles analysées ; étant plus élevé dans les racines et les feuilles basales, tandis que dans les feuilles apicales, il restait à des niveaux inférieurs. Ces données démontrent que, contrairement à l'utilisation du gène marqueur gus, la PCR en temps réel est un outil puissant pour la détection des chimères. Bien que certains auteurs aient proposé une analyse du Sud cohérente et positive comme méthodologie alternative pour surveiller la dissociation des chimères, nos données montrent qu'elle ne fournit pas suffisamment de preuves d'une transformation uniforme. Dans ce travail, cependant, la PCR en temps réel a été appliquée avec succès pour surveiller la dissociation des chimères dans les plants de tabac et les callosités d'abricot. Conclusions Nous avons développé une méthode rapide et fiable pour détecter et estimer le niveau de chimères dans les plants de tabac et d'abricot transgéniques. Cette méthode peut être étendue pour surveiller la dissociation des chimères et la récupération de plantes uniformément transformées.

Translated Description (Spanish)

Resumen Antecedentes La generación rutinaria de plantas transgénicas implica el análisis de la integración transgénica en el genoma del huésped por medio de la transferencia Southern. Sin embargo, esta técnica no puede distinguir entre tejidos uniformemente transformados y la presencia de una mezcla de células transgénicas y no transgénicas en el mismo tejido. Por otro lado, el uso de genes indicadores a menudo no detecta con precisión los tejidos quiméricos porque su expresión puede verse afectada por varios factores, incluido el silenciamiento génico y el desarrollo de la planta. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques basados en la cuantificación de la cantidad del transgén. Resultados Mostramos aquí que las quimeras son un fenómeno muy frecuente observado después de regenerar plantas transgénicas. Los análisis espaciales y temporales de plantas de tabaco y albaricoque transformadas con una amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real del transgén de neomicina fosfotransferasa ( npt II), así como de un control interno (β-actina), utilizados para normalizar la cantidad de ADN diana en cada reacción, permitieron la detección de quimeras a velocidades inesperadas. La cantidad del transgén npt II difería mucho junto con el periodo de subcultivo de estas plantas y dependía de la localización de las hojas analizadas; siendo mayor en raíces y hojas basales, mientras que en las hojas apicales se mantenía en niveles inferiores. Estos datos demuestran que, a diferencia del uso del gen marcador gus, la PCR en tiempo real es una herramienta poderosa para la detección de quimeras. Aunque algunos autores han propuesto un análisis Southern consistente y positivo como una metodología alternativa para monitorear la disociación de las quimeras, nuestros datos muestran que no proporciona suficientes pruebas de transformación uniforme. En este trabajo, sin embargo, se aplicó con éxito la PCR en tiempo real para monitorizar la disociación de quimeras en plantas de tabaco y callos de albaricoque. Conclusiones Hemos desarrollado un método rápido y fiable para detectar y estimar el nivel de quimeras en plantas transgénicas de tabaco y albaricoque. Este método se puede extender para monitorear la disociación de quimeras y la recuperación de plantas uniformemente transformadas.

Files

1472-6750-10-53.pdf

Files (758.9 kB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:ea7c2df9df5efe0420f9295e236db7f2
758.9 kB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي للكشف عن الكيميرات في التبغ والمشمش المحورين ومراقبة انفصالهما
Translated title (French)
Utilisation de la PCR quantitative en temps réel pour détecter les chimères dans le tabac et l'abricot transgéniques et pour surveiller leur dissociation
Translated title (Spanish)
Uso de PCR cuantitativa en tiempo real para detectar quimeras en tabaco transgénico y albaricoque y monitorear su disociación

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2063726147
DOI
10.1186/1472-6750-10-53

Is supplement to
https://openalex.org/W5348455 (Other)
https://openalex.org/W2986664649 (Other)
https://openalex.org/W2793991214 (Other)
https://openalex.org/W2373415676 (Other)
https://openalex.org/W2372314909 (Other)
https://openalex.org/W2363126318 (Other)
https://openalex.org/W2351541078 (Other)
https://openalex.org/W2349573545 (Other)
https://openalex.org/W2039159996 (Other)
https://openalex.org/W169693076 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
Morocco

References

  • https://openalex.org/W128699380
  • https://openalex.org/W1721868265
  • https://openalex.org/W17311167
  • https://openalex.org/W1809995607
  • https://openalex.org/W1964501424
  • https://openalex.org/W1966701618
  • https://openalex.org/W1976391864
  • https://openalex.org/W1986587865
  • https://openalex.org/W1987155223
  • https://openalex.org/W1995045055
  • https://openalex.org/W1997744191
  • https://openalex.org/W2022294009
  • https://openalex.org/W2024556021
  • https://openalex.org/W2028277651
  • https://openalex.org/W2039694564
  • https://openalex.org/W2051808648
  • https://openalex.org/W2053642757
  • https://openalex.org/W2054490088
  • https://openalex.org/W2056912747
  • https://openalex.org/W2071561174
  • https://openalex.org/W2075387095
  • https://openalex.org/W2076799541
  • https://openalex.org/W2107277218
  • https://openalex.org/W2109975826
  • https://openalex.org/W2129006023
  • https://openalex.org/W2134656510
  • https://openalex.org/W2137317624
  • https://openalex.org/W2145528249
  • https://openalex.org/W2150084967
  • https://openalex.org/W2164578725
  • https://openalex.org/W2192080449
  • https://openalex.org/W2472059134
  • https://openalex.org/W2589401389
  • https://openalex.org/W4245072240
  • https://openalex.org/W7670162