Published October 22, 2019 | Version v1
Publication Open

Development of a duplex TaqMan real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of newly emerged H5N6 influenza viruses

Creators

  • 1. Harbin Veterinary Research Institute
  • 2. Chinese Academy of Agricultural Sciences

Description

Abstract Background In 2017–2018, a new highly pathogenic H5N6 avian influenza virus (AIV) variant appeared in poultry and wild birds in Asian and European countries and caused multiple outbreaks. These variant strains are different from the H5N6 virus associated with human infection in previous years, and their genetic taxonomic status and antigenicity have changed. Therefore, revision of the primers and probes of fluorescent RT-PCR is important to detect the new H5N6 subtype AIV in poultry and reduce the risk of an epidemic in birds or humans. Methods In this study, the primers and probes including three groups of HA and four groups of NA for H5N6 influenza virus were evaluated. Then a set of ideal primer and probes were selected to further optimize the reaction system and established a method of double rRT-PCR assay. The specificity of this method was determined by using H1~H16 subtype AIV. Results The results showed that fluorescence signals were obtained for H5 virus in FAM channel and N6 virus in VIC channel, and no fluorescent signal was observed in other subtypes of avian influenza viruses. The detection limit of this assay was 69 copies for H5 and 83 copies for N6 gene. And, the variability tests of intra- and inter-assay showed excellent reproducibility. Moreover, this assay showed 100% agreement with virus isolation method in detecting samples from poultry. Conclusion The duplex rRT-PCR assay presented here has high specificity, sensitivity and reproducibility, and can be used for laboratory surveillance and rapid diagnosis of newly emerged H5N6 subtype avian influenza viruses.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

في الفترة 2017–2018، ظهر متغير جديد لفيروس إنفلونزا الطيور H5N6 شديد الإمراض في الدواجن والطيور البرية في البلدان الآسيوية والأوروبية وتسبب في تفشي العديد من الأمراض. تختلف هذه السلالات المتغيرة عن فيروس H5N6 المرتبط بالعدوى البشرية في السنوات السابقة، وقد تغيرت حالتها التصنيفية الجينية ومستضداتها. لذلك، فإن مراجعة البرايمر ومجسات RT - PCR الفلورية مهمة للكشف عن النوع الفرعي الجديد AIV من H5N6 في الدواجن وتقليل خطر حدوث وباء في الطيور أو البشر. الطرق في هذه الدراسة، تم تقييم البرايمر والمجسات بما في ذلك ثلاث مجموعات من HA وأربع مجموعات من NA لفيروس الأنفلونزا H5N6. ثم تم اختيار مجموعة من البرايمر المثالي والمجسات لزيادة تحسين نظام التفاعل وإنشاء طريقة لمعايرة rRT - PCR المزدوجة. تم تحديد خصوصية هذه الطريقة باستخدام النوع الفرعي H1~ H16 AIV. النتائج أظهرت النتائج أنه تم الحصول على إشارات الفلورسنت لفيروس H5 في قناة FAM وفيروس N6 في قناة VIC، ولم تلاحظ أي إشارة فلورسنت في أنواع فرعية أخرى من فيروسات أنفلونزا الطيور. كان الحد الأقصى للكشف عن هذا الاختبار هو 69 نسخة لـ H5 و 83 نسخة لجين N6. وأظهرت اختبارات التباين داخل المقايسة وفيما بينها قابلية ممتازة للتكاثر. علاوة على ذلك، أظهر هذا الفحص اتفاقًا بنسبة 100 ٪ مع طريقة عزل الفيروس في الكشف عن عينات من الدواجن. الاستنتاج يتميز اختبار rRT - PCR المزدوج المقدم هنا بدرجة عالية من الخصوصية والحساسية وقابلية التكاثر، ويمكن استخدامه للمراقبة المختبرية والتشخيص السريع لفيروسات إنفلونزا الطيور من النوع الفرعي H5N6 التي ظهرت حديثًا.

Translated Description (French)

Résumé Contexte En 2017–2018, une nouvelle variante hautement pathogène du virus de la grippe aviaire (AIV) H5N6 est apparue chez les volailles et les oiseaux sauvages dans les pays asiatiques et européens et a provoqué de multiples épidémies. Ces souches variantes sont différentes du virus H5N6 associé à l'infection humaine au cours des années précédentes, et leur statut taxonomique génétique et leur antigénicité ont changé. Par conséquent, la révision des amorces et des sondes de RT-PCR fluorescente est importante pour détecter le nouveau sous-type H5N6 AIV chez les volailles et réduire le risque d'épidémie chez les oiseaux ou les humains. Méthodes Dans cette étude, les amorces et les sondes comprenant trois groupes de HA et quatre groupes de NA pour le virus de la grippe H5N6 ont été évaluées. Ensuite, un ensemble d'amorces et de sondes idéales a été sélectionné pour optimiser davantage le système réactionnel et a établi une méthode de double test rRT-PCR. La spécificité de cette méthode a été déterminée en utilisant le sous-type H1~H16 AIV. Résultats Les résultats ont montré que des signaux de fluorescence ont été obtenus pour le virus H5 dans le canal FAM et le virus N6 dans le canal VIC, et aucun signal fluorescent n'a été observé dans d'autres sous-types de virus de la grippe aviaire. La limite de détection de ce test était de 69 copies pour H5 et de 83 copies pour le gène N6. Et, les tests de variabilité intra- et inter-essais ont montré une excellente reproductibilité. De plus, ce test a montré un accord de 100% avec la méthode d'isolement du virus dans la détection d'échantillons de volaille. Conclusion Le test de rRT-PCR duplex présenté ici présente une spécificité, une sensibilité et une reproductibilité élevées et peut être utilisé pour la surveillance en laboratoire et le diagnostic rapide des virus de la grippe aviaire de sous-type H5N6 nouvellement apparus.

Translated Description (Spanish)

Resumen Antecedentes En 2017–2018, una nueva variante altamente patógena del virus de la gripe aviar H5N6 (AIV) apareció en aves de corral y aves silvestres en países asiáticos y europeos y causó múltiples brotes. Estas cepas variantes son diferentes del virus H5N6 asociado con la infección humana en años anteriores, y su estado taxonómico genético y antigenicidad han cambiado. Por lo tanto, la revisión de los cebadores y sondas de RT-PCR fluorescente es importante para detectar el nuevo subtipo H5N6 AIV en aves de corral y reducir el riesgo de una epidemia en aves o humanos. Métodos En este estudio, se evaluaron los cebadores y sondas que incluyen tres grupos de HA y cuatro grupos de NA para el virus de la influenza H5N6. Luego, se seleccionó un conjunto de cebadores y sondas ideales para optimizar aún más el sistema de reacción y se estableció un método de ensayo doble de rRT-PCR. La especificidad de este método se determinó utilizando H1~H16 subtipo AIV. Resultados Los resultados mostraron que las señales de fluorescencia se obtuvieron para el virus H5 en el canal FAM y el virus N6 en el canal VIC, y no se observó señal fluorescente en otros subtipos de virus de la gripe aviar. El límite de detección de este ensayo fue de 69 copias para H5 y 83 copias para el gen N6. Y, las pruebas de variabilidad de intra- e inter-ensayo mostraron una excelente reproducibilidad. Además, este ensayo mostró un 100% de acuerdo con el método de aislamiento de virus en la detección de muestras de aves de corral. Conclusión El ensayo rRT-PCR dúplex que se presenta aquí tiene una alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, y se puede utilizar para la vigilancia de laboratorio y el diagnóstico rápido de los virus de la gripe aviar del subtipo H5N6 recién surgidos.

Files

s12985-019-1229-2.pdf

Files (947.2 kB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:264897b31c3515aee4d4a38f064b236d
947.2 kB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
تطوير اختبار TAQMAN في الوقت الفعلي RT - PCR للكشف المتزامن عن فيروسات إنفلونزا H5N6 الناشئة حديثًا
Translated title (French)
Développement d'un test RT-PCR en temps réel duplex TaqMan pour la détection simultanée des virus grippaux H5N6 nouvellement apparus
Translated title (Spanish)
Desarrollo de un ensayo dúplex de RT-PCR en tiempo real TaqMan para la detección simultánea de virus de la gripe H5N6 recién surgidos

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2981927831
DOI
10.1186/s12985-019-1229-2

Is supplement to
https://openalex.org/W2381363304 (Other)
https://openalex.org/W2378133410 (Other)
https://openalex.org/W2352678222 (Other)
https://openalex.org/W2350899495 (Other)
https://openalex.org/W2347644781 (Other)
https://openalex.org/W2285562173 (Other)
https://openalex.org/W2055149792 (Other)
https://openalex.org/W1995527227 (Other)
https://openalex.org/W1553543121 (Other)
https://openalex.org/W1504424866 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
China

References

  • https://openalex.org/W2114585469
  • https://openalex.org/W2115055359
  • https://openalex.org/W2117386204
  • https://openalex.org/W2128932527
  • https://openalex.org/W2158989551
  • https://openalex.org/W2162694815
  • https://openalex.org/W2234768749
  • https://openalex.org/W2339835180
  • https://openalex.org/W2398662415
  • https://openalex.org/W2515337466
  • https://openalex.org/W2519834751
  • https://openalex.org/W2557499142
  • https://openalex.org/W2564814218
  • https://openalex.org/W2571812104
  • https://openalex.org/W2572593440
  • https://openalex.org/W2591584396
  • https://openalex.org/W2592369684
  • https://openalex.org/W2592609485
  • https://openalex.org/W2592869043
  • https://openalex.org/W2594577182
  • https://openalex.org/W2605861301
  • https://openalex.org/W2741050401
  • https://openalex.org/W2745814241
  • https://openalex.org/W2783844262
  • https://openalex.org/W2791710760
  • https://openalex.org/W2800689566
  • https://openalex.org/W2802408903