Published January 16, 2016
| Version v1
Publication
Open
A potent betulinic acid analogue ascertains an antagonistic mechanism between autophagy and proteasomal degradation pathway in HT-29 cells
- 1. Indian Institute of Chemical Biology
Description
Betulinic acid (BA), a member of pentacyclic triterpenes has shown important biological activities like anti-bacterial, anti-malarial, anti-inflammatory and most interestingly anticancer property. To overcome its poor aqueous solubility and low bioavailability, structural modifications of its functional groups are made to generate novel lead(s) having better efficacy and less toxicity than the parent compound. BA analogue, 2c was found most potent inhibitor of colon cancer cell line, HT-29 cells with IC50 value 14.9 μM which is significantly lower than standard drug 5-fluorouracil as well as parent compound, Betulinic acid. We have studied another mode of PCD, autophagy which is one of the important constituent of cellular catabolic system as well as we also studied proteasomal degradation pathway to investigate whole catabolic pathway after exploration of 2c on HT-29 cells.Mechanism of autophagic cell death was studied using fluorescent dye like acridine orange (AO) and monodansylcadaverin (MDC) staining by using fluorescence microscopy. Various autophagic protein expression levels were determined by Western Blotting, qRT-PCR and Immunostaining. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) was used to study the colocalization of various autophagic proteins. These were accompanied by formation of autophagic vacuoles as revealed by FACS and transmission electron microscopy (TEM). Proteasomal degradation pathway was studied by proteasome-Glo™ assay systems using luminometer.The formation of autophagic vacuoles in HT-29 cells after 2c treatment was determined by fluorescence staining--confirming the occurrence of autophagy. In addition, 2c was found to alter expression levels of different autophagic proteins like Beclin-1, Atg 5, Atg 7, Atg 5-Atg 12, LC3B and autophagic adapter protein, p62. Furthermore we found the formation of autophagolysosome by colocalization of LAMP-1 with LC3B, LC3B with Lysosome, p62 with lysosome. Finally, as proteasomal degradation pathway downregulated after 2c treatment colocalization of ubiquitin with lysosome and LC3B with p62 was studied to confirm that protein degradation in autophagy induced HT-29 cells follows autolysosomal pathway.In summary, betulinic acid analogue, 2c was able to induce autophagy in HT-29 cells and as proteasomal degradation pathway downregulated after 2c treatment so protein degradation in autophagy induced HT-29 cells follows autolysosomal pathway.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
أظهر حمض البيتولينيك (BA)، وهو عضو في ثلاثي التربين خماسي الحلقات، أنشطة بيولوجية مهمة مثل الخصائص المضادة للبكتيريا والمضادة للملاريا والمضادة للالتهابات والأكثر إثارة للاهتمام المضادة للسرطان. للتغلب على ضعف قابلية الذوبان المائي وانخفاض التوافر البيولوجي، يتم إجراء تعديلات هيكلية لمجموعاتها الوظيفية لتوليد رصاص(رصاصات) جديدة ذات فعالية أفضل وسمية أقل من المركب الأصلي. تم العثور على التماثلية BA، 2C المثبط الأكثر فعالية لخط خلايا سرطان القولون، خلايا HT -29 مع قيمة IC50 14.9 ميكرومتر وهو أقل بكثير من الدواء القياسي 5 فلورويوراسيل وكذلك المركب الأصلي، حمض البيتولينيك. لقد درسنا طريقة أخرى للكلور ثنائي الفينيل متعدد الكلور، البلعمة الذاتية التي تعد واحدة من المكونات المهمة للنظام التقويضي الخلوي وكذلك درسنا أيضًا مسار التحلل البروتيني الصبغي للتحقيق في مسار تقويضي كامل بعد استكشاف 2C على خلايا HT -29. تمت دراسة آلية موت الخلايا البلعمة الذاتية باستخدام صبغة الفلورسنت مثل تلطيخ أكريدين البرتقال (AO) ومونودانسيلكادافيرين (MDC) باستخدام المجهر الفلوري. تم تحديد مستويات التعبير البروتيني الذاتي المختلفة عن طريق النشاف الغربي، qRT - PCR والتلوين المناعي. تم استخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) لدراسة توطين مختلف البروتينات ذاتية البلعمة. كانت هذه مصحوبة بتكوين فجوات ذاتية البلعمة كما كشف عنها نظام مراقبة الأصول الميدانية والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM). تمت دراسة مسار التحلل البروتيزومي بواسطة أنظمة مقايسة بروتيزوم- جلو™ باستخدام مقياس الإضاءة. تم تحديد تكوين فجوات البلعمة الذاتية في خلايا HT -29 بعد علاج 2C عن طريق تلوين الفلورة - مما يؤكد حدوث البلعمة الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، وجد أن 2c يغير مستويات التعبير عن البروتينات البلعمة الذاتية المختلفة مثل Beclin -1 و Atg 5 و Atg 7 و Atg 5 - Atg 12 و LC3B وبروتين محول البلعمة الذاتية، ص 62. علاوة على ذلك، وجدنا تكوين حالة البلعمة الذاتية عن طريق توطين LAMP -1 مع LC3B، LC3B مع الليزوزوم، p62 مع الليزوزوم. أخيرًا، نظرًا لأن مسار تحلل البروتينات الصبغية قد تم تنظيمه بعد توطين العلاج 2C لليوبيكويتين مع الليزوزوم و LC3B مع p62، فقد تمت دراسته للتأكد من أن تحلل البروتين في خلايا HT -29 المستحثة بالبلعمة الذاتية يتبع مسار التحلل الذاتي. باختصار، نظير حمض البيتولينيك، كان 2C قادرًا على تحفيز الالتهام الذاتي في خلايا HT -29 ومسار التحلل البروتيازومي الذي تم تنظيمه بعد علاج 2C، لذلك فإن تحلل البروتين في خلايا HT -29 المستحثة بالبلعمة الذاتية يتبع مسار التحلل الذاتي.Translated Description (French)
L'acide bétulinique (BA), un membre des triterpènes pentacycliques, a montré d'importantes activités biologiques comme des propriétés antibactériennes, antipaludiques, anti-inflammatoires et surtout anticancéreuses. Pour surmonter sa faible solubilité aqueuse et sa faible biodisponibilité, des modifications structurelles de ses groupes fonctionnels sont apportées pour générer de nouveaux plombs ayant une meilleure efficacité et moins de toxicité que le composé parent. L'analogue BA, 2c, a été trouvé comme l'inhibiteur le plus puissant de la lignée cellulaire du cancer du côlon, les cellules HT-29 avec une valeur IC50 de 14,9 μM, ce qui est significativement inférieur au médicament standard, le 5-fluorouracile, ainsi qu'au composé parent, l'acide bétulinique. Nous avons étudié un autre mode de PCD, l'autophagie qui est l'un des constituants importants du système catabolique cellulaire ainsi que nous avons également étudié la voie de dégradation protéasomique pour étudier la voie catabolique entière après exploration de 2c sur les cellules HT-29. Le mécanisme de la mort cellulaire autophagique a été étudié en utilisant un colorant fluorescent comme l'acridine orange (AO) et la coloration à la monodansylcadaverine (MDC) en utilisant la microscopie à fluorescence. Divers niveaux d'expression des protéines autophagiques ont été déterminés par Western Blot, qRT-PCR et immunocoloration. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) a été utilisée pour étudier la colocalisation de diverses protéines autophagiques. Celles-ci étaient accompagnées de la formation de vacuoles autophagiques révélées par FACS et la microscopie électronique à transmission (TEM). La voie de dégradation protéasomique a été étudiée par des systèmes de dosage du protéasome-Glo™ à l'aide d'un luminomètre. La formation de vacuoles autophagiques dans les cellules HT-29 après traitement par 2c a été déterminée par coloration par fluorescence, confirmant l'apparition de l'autophagie. En outre, 2c a été trouvé pour modifier les niveaux d'expression de différentes protéines autophagiques comme Beclin-1, Atg 5, Atg 7, Atg 5-Atg 12, LC3B et la protéine adaptatrice autophagique, p62. De plus, nous avons trouvé la formation d'autophagolysosome par colocalisation de LAMP-1 avec LC3B, LC3B avec Lysosome, p62 avec lysosome. Enfin, comme la voie de dégradation protéasomique est régulée à la baisse après le traitement 2c, la colocalisation de l'ubiquitine avec le lysosome et de la LC3B avec la p62 a été étudiée pour confirmer que la dégradation des protéines dans les cellules HT-29 induites par l'autophagie suit la voie autolysosomale. En résumé, l'analogue de l'acide bétulinique, 2c a pu induire l'autophagie dans les cellules HT-29 et comme la voie de dégradation protéasomique est régulée à la baisse après le traitement 2c, la dégradation des protéines dans les cellules HT-29 induites par l'autophagie suit la voie autolysosomale.Translated Description (Spanish)
El ácido betulínico (BA), miembro de los triterpenos pentacíclicos, ha demostrado importantes actividades biológicas como propiedades antibacterianas, antimaláricas, antiinflamatorias y, lo que es más interesante, anticancerígenas. Para superar su escasa solubilidad acuosa y baja biodisponibilidad, se realizan modificaciones estructurales de sus grupos funcionales para generar nuevos conductores que tengan mejor eficacia y menos toxicidad que el compuesto original. Análogo de BA, 2c fue el inhibidor más potente de la línea celular de cáncer de colon, células HT-29 con un valor de IC50 de 14.9 μM que es significativamente menor que el fármaco estándar 5-fluorouracilo, así como el compuesto original, ácido betulínico. Hemos estudiado otro modo de PCD, la autofagia, que es uno de los constituyentes importantes del sistema catabólico celular, así como también estudiamos la vía de degradación proteasómica para investigar la vía catabólica completa después de la exploración de 2c en células HT-29. El mecanismo de muerte celular autofágica se estudió utilizando tinte fluorescente como naranja de acridina (AO) y tinción de monodansilcadaverina (MDC) mediante microscopía de fluorescencia. Se determinaron varios niveles de expresión de proteínas autofágicas mediante transferencia Western, qRT-PCR e inmunotinción. Se utilizó microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para estudiar la colocalización de varias proteínas autofágicas. Estos fueron acompañados por la formación de vacuolas autofágicas según lo revelado por FACS y microscopía electrónica de transmisión (TEM). La vía de degradación proteasómica se estudió mediante sistemas de ensayo proteasoma-Glo™ utilizando luminómetro. La formación de vacuolas autofágicas en células HT-29 después del tratamiento 2c se determinó mediante tinción de fluorescencia, confirmando la aparición de autofagia. Además, se encontró que 2c altera los niveles de expresión de diferentes proteínas autofágicas como Beclin-1, Atg 5, Atg 7, Atg 5-Atg 12, LC3B y la proteína adaptadora autofágica, p62. Además, encontramos la formación de autofagolisosoma por colocalización de LAMP-1 con LC3B, LC3B con lisosoma, p62 con lisosoma. Finalmente, como la vía de degradación proteasómica regulada negativamente después del tratamiento con 2c, se estudió la colocalización de ubiquitina con lisosoma y LC3B con p62 para confirmar que la degradación de proteínas en células HT-29 inducidas por autofagia sigue la vía autolisosómica. En resumen, el análogo de ácido betulínico, 2c, fue capaz de inducir la autofagia en células HT-29 y como la vía de degradación proteasómica regulada negativamente después del tratamiento con 2c, por lo que la degradación de proteínas en células HT-29 inducidas por autofagia sigue la vía autolisosómica.Files
s12885-016-2055-1.pdf
Files
(2.3 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:6e8f6b3485a9780fcf52a8490586ef29
|
2.3 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- يتأكد التناظرية القوية لحمض البيتولينيك من وجود آلية معادية بين البلعمة الذاتية ومسار التحلل البروتيني في خلايا HT -29
- Translated title (French)
- Un puissant analogue de l'acide bétulinique détermine un mécanisme antagoniste entre l'autophagie et la voie de dégradation protéasomale dans les cellules HT-29
- Translated title (Spanish)
- Un potente análogo de ácido betulínico determina un mecanismo antagonista entre la autofagia y la vía de degradación proteasómica en células HT-29
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2254809874
- DOI
- 10.1186/s12885-016-2055-1
References
- https://openalex.org/W1170929448
- https://openalex.org/W1485135754
- https://openalex.org/W1502844859
- https://openalex.org/W151873731
- https://openalex.org/W1532433391
- https://openalex.org/W1599366903
- https://openalex.org/W1782545213
- https://openalex.org/W1973884972
- https://openalex.org/W1976437976
- https://openalex.org/W1977767269
- https://openalex.org/W1977773503
- https://openalex.org/W1979952830
- https://openalex.org/W1992125695
- https://openalex.org/W1993175857
- https://openalex.org/W1998192361
- https://openalex.org/W2015880326
- https://openalex.org/W2018636808
- https://openalex.org/W2020337923
- https://openalex.org/W2024105361
- https://openalex.org/W2026834042
- https://openalex.org/W2027708101
- https://openalex.org/W2035692638
- https://openalex.org/W2039046297
- https://openalex.org/W2041033535
- https://openalex.org/W2061660584
- https://openalex.org/W2074310251
- https://openalex.org/W2075065864
- https://openalex.org/W2082246619
- https://openalex.org/W2088006111
- https://openalex.org/W2089333686
- https://openalex.org/W2092321143
- https://openalex.org/W2095510701
- https://openalex.org/W2095917499
- https://openalex.org/W2096308078
- https://openalex.org/W2097204034
- https://openalex.org/W2111109862
- https://openalex.org/W2115782001
- https://openalex.org/W2120648308
- https://openalex.org/W2128617170
- https://openalex.org/W2137276707
- https://openalex.org/W2142845200
- https://openalex.org/W2146124002
- https://openalex.org/W2155342341
- https://openalex.org/W2156320420
- https://openalex.org/W2157053804
- https://openalex.org/W2301131921
- https://openalex.org/W2743254891