Published April 11, 2017 | Version v1
Publication Open

Dual color fluorescence in situ hybridization (FISH) assays for detecting Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complexes and related pathogens in cultures

Creators

  • 1. ID-FISH Technology (United States)
  • 2. Kasturba Medical College, Manipal
  • 3. Manipal Academy of Higher Education
  • 4. University of California, San Francisco
  • 5. Universidad Peruana Cayetano Heredia
  • 6. California Department of Public Health

Description

Two rapid dual color fluorescence in situ hybridization (FISH) assays were evaluated for detecting M. tuberculosis and related pathogens in cultures. The MN Genus-MTBC FISH assay uses an orange fluorescent probe specific for the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) and a green fluorescent probe specific for the Mycobacterium and Nocardia genera (MN Genus) to detect and distinguish MTBC from other Mycobacteria and Nocardia. A complementary MTBC-MAC FISH assay uses green and orange fluorescent probes specific for the MTBC and M. avium complex (MAC) respectively to identify and differentiate the two species complexes. The assays are performed on acid-fast staining bacteria from liquid or solid cultures in less than two hours. Forty-three of 44 reference mycobacterial isolates were correctly identified by the MN Genus-specific probe as Mycobacterium species, with six of these correctly identified as MTBC with the MTBC-specific probe and 14 correctly as MAC by the MAC-specific probe. Of the 25 reference isolates of clinically relevant pathogens of other genera tested, only four isolates representing two species of Corynebacterium gave a positive signal with the MN Genus probe. None of these 25 isolates were detected by the MTBC and MAC specific probes. A total of 248 cultures of clinical mycobacterial isolates originating in India, Peru and the USA were also tested by FISH assays. DNA sequence of a part of the 23S ribosomal RNA gene amplified by PCR was obtained from 243 of the 248 clinical isolates. All 243 were confirmed by DNA sequencing as Mycobacterium species, with 157 and 50 of these identified as belonging to the MTBC and the MAC, respectively. The accuracy of the MN Genus-, MTBC-and MAC -specific probes in identifying these 243 cultures in relation to their DNA sequence-based identification was 100%. All ten isolates of Nocardia, (three reference strains and seven clinical isolates) tested were detected by the MN Genus-specific probe but not the MTBC- or MAC-specific probes. The limit of detection for M. tuberculosis was determined to be 5.1x104 cfu per ml and for M. avium 1.5x104 cfu per ml in liquid cultures with the respective MTBC- and MAC-specific probes in both the MN Genus-MTBC and MTBC-MAC FISH assays. The only specialized equipment needed for the FISH assays is a standard light microscope fitted with a LED light source and appropriate filters. The two FISH assays meet an important diagnostic need in peripheral laboratories of resource-limited tuberculosis-endemic countries.

⚠️ This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%

Translated Description (Arabic)

تم تقييم اثنين من مقايسات التهجين الموضعي المزدوجة اللون (FISH) للكشف عن مرض السل ومسببات الأمراض ذات الصلة في الثقافات. يستخدم اختبار MN Genus - MTBC FISH مسبارًا فلوريًا برتقاليًا خاصًا بمجمع المتفطرة السلية (MTBC) ومسبارًا فلوريًا أخضر خاصًا بجنس المتفطرة والنوكارديا (MN Genus) لاكتشاف وتمييز MTBC عن المتفطرة والنوكارديا الأخرى. يستخدم اختبار الأسماك التكميلي MTBC - MAC مجسات الفلورسنت الخضراء والبرتقالية الخاصة بمركب MTBC و M. Avium (MAC) على التوالي لتحديد وتمييز مجمعات النوعين. يتم إجراء الاختبارات على البكتيريا سريعة التلطيخ بالحمض من المستنبتات السائلة أو الصلبة في أقل من ساعتين. تم تحديد ثلاثة وأربعين من 44 من العزلات الفطرية المرجعية بشكل صحيح من قبل المسبار الخاص بجنس MN على أنها أنواع من المتفطرات، مع تحديد ستة منها بشكل صحيح على أنها MTBC مع المسبار الخاص بـ MTBC و 14 بشكل صحيح على أنها MAC من قبل المسبار الخاص بـ MAC. من بين 25 عزلًا مرجعيًا لمسببات الأمراض ذات الصلة سريريًا للأجناس الأخرى التي تم اختبارها، أعطت أربعة عزلات فقط تمثل نوعين من الوتدية إشارة إيجابية باستخدام مسبار جنس MN. لم يتم اكتشاف أي من هذه العزلات الـ 25 بواسطة مسابير MTBC و MAC المحددة. كما تم اختبار ما مجموعه 248 مزرعة من مستنبتات البكتيريا الفطرية السريرية التي نشأت في الهند وبيرو والولايات المتحدة الأمريكية من خلال فحوصات الأسماك. تم الحصول على تسلسل الحمض النووي لجزء من جين الحمض النووي الريبي الريبوسومي 23S الذي تم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل من 243 من 248 عزلًا سريريًا. تم تأكيد جميع 243 من خلال تسلسل الحمض النووي على أنها أنواع من المتفطرات، مع تحديد 157 و 50 من هذه الأنواع على أنها تنتمي إلى MTBC و MAC، على التوالي. كانت دقة المسابير الخاصة بجنس MN و MTBC و MAC في تحديد هذه الثقافات الـ 243 فيما يتعلق بتحديدها القائم على تسلسل الحمض النووي 100 ٪. تم اكتشاف جميع عزلات النوكارديا العشرة، (ثلاث سلالات مرجعية وسبع عزلات سريرية) التي تم اختبارها بواسطة مسبار MN Genus الخاص ولكن ليس مسابير MTBC أو MAC الخاصة. تم تحديد حد الكشف عن السل M. ليكون 5.1x104 cfu لكل مل و M. avium 1.5x104 cfu لكل مل في المزارع السائلة مع المسابير الخاصة بـ MTBC و MAC في كل من مقايسات الأسماك MN Genus - MTBC و MTBC - MAC. المعدات المتخصصة الوحيدة اللازمة لمقايسات الأسماك هي مجهر ضوئي قياسي مزود بمصدر ضوء LED ومرشحات مناسبة. تلبي مقايستا الأسماك حاجة تشخيصية مهمة في المختبرات الطرفية للبلدان الموبوءة بالسل المحدودة الموارد.

Translated Description (French)

Deux tests rapides d'hybridation in situ par fluorescence bicolore (FISH) ont été évalués pour détecter M. tuberculosis et les agents pathogènes apparentés dans les cultures. Le test FISH MN Genus-MTBC utilise une sonde fluorescente orange spécifique du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTBC) et une sonde fluorescente verte spécifique des genres Mycobacterium et Nocardia (MN Genus) pour détecter et distinguer le MTBC des autres Mycobacteria et Nocardia. Un test complémentaire MTBC-MAC FISH utilise des sondes fluorescentes vertes et oranges spécifiques du complexe MTBC et M. avium (MAC) respectivement pour identifier et différencier les deux complexes d'espèces. Les dosages sont effectués sur des bactéries de coloration acido-résistantes provenant de cultures liquides ou solides en moins de deux heures. Quarante-trois des 44 isolats mycobactériens de référence ont été correctement identifiés par la sonde spécifique au genre MN comme espèce Mycobacterium, avec six d'entre eux correctement identifiés comme MTBC avec la sonde spécifique au MTBC et 14 correctement comme MAC par la sonde spécifique au MAC. Sur les 25 isolats de référence d'agents pathogènes cliniquement pertinents d'autres genres testés, seuls quatre isolats représentant deux espèces de Corynebacterium ont donné un signal positif avec la sonde MN Genus. Aucun de ces 25 isolats n'a été détecté par les sondes spécifiques MTBC et MAC. Un total de 248 cultures d'isolats cliniques de mycobactéries originaires de l'Inde, du Pérou et des États-Unis ont également été testées par des tests FISH. La séquence d'ADN d'une partie du gène de l'ARN ribosomique 23S amplifié par PCR a été obtenue à partir de 243 des 248 isolats cliniques. Tous les 243 ont été confirmés par séquençage de l'ADN en tant qu'espèces de Mycobacterium, avec 157 et 50 d'entre eux identifiés comme appartenant respectivement au MTBC et au MAC. La précision des sondes spécifiques au genre MN, MTBC et MAC dans l'identification de ces 243 cultures par rapport à leur identification basée sur la séquence d'ADN était de 100 %. Les dix isolats de Nocardia (trois souches de référence et sept isolats cliniques) testés ont été détectés par la sonde spécifique au genre MN, mais pas par les sondes spécifiques au MTBC ou au MAC. La limite de détection de M. tuberculosis a été déterminée à 5,1 x 104 ufc par ml et pour M. avium 1,5 x 104 ufc par ml dans des cultures liquides avec les sondes spécifiques MTBC et MAC respectives dans les essais FISH MN Genus-MTBC et MTBC-MAC. Le seul équipement spécialisé nécessaire pour les essais FISH est un microscope optique standard équipé d'une source de lumière LED et de filtres appropriés. Les deux tests FISH répondent à un besoin diagnostique important dans les laboratoires périphériques des pays où les ressources sont limitées et où la tuberculose est endémique.

Translated Description (Spanish)

Se evaluaron dos ensayos rápidos de hibridación in situ de fluorescencia de doble color (FISH) para detectar M. tuberculosis y patógenos relacionados en cultivos. El ensayo FISH del género MN-MTBC utiliza una sonda fluorescente naranja específica para el complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) y una sonda fluorescente verde específica para los géneros Mycobacterium y Nocardia (género MN) para detectar y distinguir MTBC de otras micobacterias y Nocardia. Un ensayo complementario MTBC-MAC FISH utiliza sondas fluorescentes verdes y naranjas específicas para el complejo MTBC y M. avium (MAC) respectivamente para identificar y diferenciar los dos complejos de especies. Los ensayos se realizan en bacterias de tinción ácido-resistente de cultivos líquidos o sólidos en menos de dos horas. Cuarenta y tres de 44 aislados de micobacterias de referencia fueron identificados correctamente por la sonda específica del género MN como especies de Mycobacterium, con seis de estos correctamente identificados como MTBC con la sonda específica de MTBC y 14 correctamente como MAC por la sonda específica de Mac. De los 25 aislados de referencia de patógenos clínicamente relevantes de otros géneros analizados, solo cuatro aislados que representan dos especies de Corynebacterium dieron una señal positiva con la sonda del género MN. Ninguno de estos 25 aislados fue detectado por las sondas específicas de MTBC y MAC. También se probaron un total de 248 cultivos de aislados clínicos de micobacterias originarios de India, Perú y EE. UU. mediante ensayos FISH. La secuencia de ADN de una parte del gen de ARN ribosómico 23S amplificado por PCR se obtuvo de 243 de los 248 aislados clínicos. Las 243 se confirmaron mediante secuenciación de ADN como especies de Mycobacterium, con 157 y 50 de estas identificadas como pertenecientes al MTBC y al MAC, respectivamente. La precisión de las sondas específicas del género MN, MTBC y MAC en la identificación de estos 243 cultivos en relación con su identificación basada en la secuencia de ADN fue del 100%. Los diez aislados de Nocardia (tres cepas de referencia y siete aislados clínicos) analizados fueron detectados por la sonda específica del género MN, pero no por las sondas específicas de MTBC o Mac. Se determinó que el límite de detección para M. tuberculosis era de 5.1x104 ufc por ml y para M. avium 1.5x104 ufc por ml en cultivos líquidos con las respectivas sondas específicas de MTBC y Mac en los ensayos FISH DEL GÉNERO MN-MTBC y MTBC-MAC. El único equipo especializado necesario para los ensayos FISH es un microscopio óptico estándar equipado con una fuente de luz LED y filtros apropiados. Los dos ensayos FISH satisfacen una importante necesidad de diagnóstico en laboratorios periféricos de países endémicos de tuberculosis con recursos limitados.

Files

journal.pone.0174989&type=printable.pdf

Files (1.1 MB)

⚠️ Please wait a few minutes before your translated files are ready ⚠️ Note: Some files might be protected thus translations might not work.
Name Size Download all
md5:1b5bee7d6ab7e841cffacdcd08f66abe
1.1 MB
Preview Download

Additional details

Additional titles

Translated title (Arabic)
مقايسات التهجين الفلوري ثنائي اللون في الموقع (FISH) للكشف عن المتفطرة السلية والمتفطرة الطيرية والعوامل الممرضة ذات الصلة في الثقافات
Translated title (French)
Essais d'hybridation in situ à fluorescence double couleur (FISH) pour détecter les complexes Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium avium et les agents pathogènes apparentés dans les cultures
Translated title (Spanish)
Ensayos de hibridación in situ con fluorescencia de doble color (FISH) para detectar complejos de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium avium y patógenos relacionados en cultivos

Identifiers

Other
https://openalex.org/W2607439261
DOI
10.1371/journal.pone.0174989

Is supplement to
https://openalex.org/W2794392459 (Other)
https://openalex.org/W2607439261 (Other)
https://openalex.org/W2125665652 (Other)
https://openalex.org/W2116055141 (Other)
https://openalex.org/W2073582595 (Other)
https://openalex.org/W2064903227 (Other)
https://openalex.org/W1975941686 (Other)
https://openalex.org/W1938212355 (Other)
https://openalex.org/W1758319683 (Other)
https://openalex.org/W1567338735 (Other)

GreSIS Basics Section

Is Global South Knowledge
Yes
Country
India

References

  • https://openalex.org/W1826845577
  • https://openalex.org/W2021329869
  • https://openalex.org/W2022298315
  • https://openalex.org/W2036904310
  • https://openalex.org/W2047958112
  • https://openalex.org/W2058409418
  • https://openalex.org/W2101824041
  • https://openalex.org/W2102135808
  • https://openalex.org/W2130591197
  • https://openalex.org/W2132748880
  • https://openalex.org/W2137190175
  • https://openalex.org/W2137820921
  • https://openalex.org/W2151198507
  • https://openalex.org/W2156422214
  • https://openalex.org/W2190851400
  • https://openalex.org/W2318545778
  • https://openalex.org/W2341862408
  • https://openalex.org/W2409324203
  • https://openalex.org/W3610929