Published January 1, 1999
| Version v1
Publication
Long RT-PCR Amplification of the Entire Coding Sequence of the Polycystic Kidney Disease 1 (<i>PKD1</i>) Gene
- 1. Siriraj Hospital
- 2. Mahidol University
Description
Characterization of mutations of the PKD1 gene has been limited by the fact that three-fourths of this gene at its 5' end is homologous to sequences of at least three other genes on the same chromosome. We have therefore developed a method of long reverse transcription PCR for selective amplification of the entire coding sequence of the PKD1 gene from its mRNA. A PCR primer specific to the sequence in the 3' unique region of the PKD1 gene was synthesized for use coupled with a primer binding to sequence in the homologous region at a distance of about 13.6 kb apart. The commercial availability of RNase H-free reverse transcriptase for long cDNA synthesis and of an enzyme mixture containing Taq and Pfu DNA polymerases for long-range PCR have made this development possible. The long PCR product was proven to be derived from PKD1-mRNA. The results clearly indicated that the long PCR product contained the coding sequence derived from PKD1-mRNA. To our knowledge, this is the first report of a procedure that can reproducibly isolate full-length PKD1 coding sequence from its mRNA transcript, which will prove useful for screening and characterization of mutations in the PKD1 gene.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
تم تحديد توصيف طفرات جين PKD1 من خلال حقيقة أن ثلاثة أرباع هذا الجين في نهايته 5'متماثل مع تسلسل ثلاثة جينات أخرى على الأقل على نفس الكروموسوم. لذلك قمنا بتطوير طريقة للنسخ العكسي الطويل PCR للتضخيم الانتقائي لتسلسل الترميز الكامل لجين PKD1 من mRNA الخاص به. تم تصنيع تمهيدي PCR خاص بالتسلسل في المنطقة الفريدة 3'من جين PKD1 للاستخدام إلى جانب ارتباط تمهيدي بالتسلسل في المنطقة المتماثلة على مسافة حوالي 13.6 كيلوبايت. إن التوافر التجاري للنسخة العكسية الخالية من RNase H لتخليق الحمض النووي طويل الأمد وخليط الإنزيم الذي يحتوي على بلمرة الحمض النووي Taq و Pfu من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى جعل هذا التطور ممكنًا. وقد ثبت أن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل مشتق من PKD1 - mRNA. أشارت النتائج بوضوح إلى أن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل يحتوي على تسلسل الترميز المشتق من PKD1 - mRNA. على حد علمنا، هذا هو التقرير الأول لإجراء يمكن أن يعزل تسلسل ترميز PKD1 كامل الطول بشكل قابل للتكرار من نسخة mRNA الخاصة به، والتي ستكون مفيدة لفحص وتوصيف الطفرات في جين PKD1.Translated Description (French)
La caractérisation des mutations du gène PKD1 a été limitée par le fait que les trois quarts de ce gène à son extrémité 5'sont homologues à des séquences d'au moins trois autres gènes sur le même chromosome. Nous avons donc développé une méthode de PCR de transcription inverse longue pour l'amplification sélective de la totalité de la séquence codante du gène PKD1 à partir de son ARNm. Une amorce PCR spécifique de la séquence dans la région unique 3'du gène PKD1 a été synthétisée pour une utilisation couplée à une amorce se liant à la séquence dans la région homologue à une distance d'environ 13,6 kb. La disponibilité commerciale de la transcriptase inverse sans RNase H pour la synthèse d'ADNc à long terme et d'un mélange d'enzymes contenant des ADN polymérases Taq et Pfu pour la PCR à longue distance ont rendu ce développement possible. Il a été prouvé que le produit PCR long est dérivé de l'ARNm PKD1. Les résultats ont clairement indiqué que le produit PCR long contenait la séquence codante dérivée de l'ARNm PKD1. À notre connaissance, il s'agit du premier rapport d'une procédure permettant d'isoler de manière reproductible la séquence codante complète de PKD1 à partir de son transcrit d'ARNm, ce qui s'avérera utile pour le criblage et la caractérisation des mutations du gène PKD1.Translated Description (Spanish)
La caracterización de mutaciones del gen PKD1 se ha visto limitada por el hecho de que tres cuartas partes de este gen en su extremo 5'es homólogo a secuencias de al menos otros tres genes en el mismo cromosoma. Por lo tanto, hemos desarrollado un método de PCR de transcripción inversa larga para la amplificación selectiva de toda la secuencia codificante del gen PKD1 a partir de su ARNm. Se sintetizó un cebador de PCR específico para la secuencia en la región única 3'del gen PKD1 para su uso acoplado con un cebador que se une a la secuencia en la región homóloga a una distancia de aproximadamente 13.6 kb. La disponibilidad comercial de la transcriptasa inversa libre de RNasa H para la síntesis de ADNc largo y de una mezcla enzimática que contiene ADN polimerasas Taq y Pfu para PCR de largo alcance han hecho posible este desarrollo. Se demostró que el producto de PCR largo se deriva de ARNm de PKD1. Los resultados indicaron claramente que el producto de PCR largo contenía la secuencia codificante derivada de ARNm de PKD1. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de un procedimiento que puede aislar de forma reproducible la secuencia codificante de PKD1 de longitud completa a partir de su transcrito de ARNm, lo que resultará útil para el cribado y la caracterización de mutaciones en el gen PKD1.Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تضخيم RT - PCR طويل لتسلسل الترميز الكامل لجين مرض الكلى متعدد الكيسات 1<i> (</i>PKD1)
- Translated title (French)
- Amplification RT-PCR longue de toute la séquence codante du gène de la polykystose rénale 1 (<i>PKD1</i>)
- Translated title (Spanish)
- Amplificación RT-PCR larga de toda la secuencia de codificación del gen de la enfermedad renal poliquística 1 (<i>PKD1</i>)
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W2301302249
- DOI
- 10.2144/99261rr01
References
- https://openalex.org/W156217820
- https://openalex.org/W1987666378
- https://openalex.org/W2002837417
- https://openalex.org/W2021243296
- https://openalex.org/W2068821489
- https://openalex.org/W2074061748
- https://openalex.org/W2105514165
- https://openalex.org/W2124191230
- https://openalex.org/W2282558901
- https://openalex.org/W2412745074