Published February 13, 2020
| Version v1
Publication
Open
Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia
Creators
- 1. University of Cambridge
- 2. Eijkman Institute for Molecular Biology
- 3. University of the Philippines Manila
- 4. The Alan Turing Institute
Description
Abstract Background Dengue virus (DENV) infects hundreds of thousands of people annually in Indonesia. However, DENV sequence data from the country are limited, as samples from outbreaks must be shipped across long-distances to suitably equipped laboratories to be sequenced. This approach is time-consuming, expensive, and frequently results in failure due to low viral load or degradation of the RNA genome. Methods We evaluated a method designed to address this challenge, using the 'Primal Scheme' multiplex PCR tiling approach to rapidly generate short, overlapping amplicons covering the complete DENV coding-region, and sequencing the amplicons on the portable Nanopore MinION device. The resulting sequence data was assessed in terms of genome coverage, consensus sequence accuracy and by phylogenetic analysis. Results The multiplex approach proved capable of producing near complete coding-region coverage from all samples tested ( $$ \overline{x} $$ x¯ = 99.96%, n = 18), 61% of which could not be fully amplified using the current, long-amplicon PCR, approach. Nanopore-generated consensus sequences were found to be between 99.17–99.92% identical to those produced by high-coverage Illumina sequencing. Consensus accuracy could be improved by masking regions below 20X coverage depth (99.69–99.92%). However, coding-region coverage was reduced at this depth ( $$ \overline{x} $$ x¯ = 93.48%). Nanopore and Illumina consensus sequences generated from the same samples formed monophyletic clades on phylogenetic analysis, and Indonesian consensus sequences accurately clustered by geographical origin. Conclusion The multiplex, short-amplicon approach proved superior for amplifying DENV genomes from clinical samples, particularly when the virus was present at low concentrations. The accuracy of Nanopore-generated consensus sequences from these amplicons was sufficient for identifying the geographic origin of the samples, demonstrating that the approach can be a useful tool for identifying and monitoring DENV clades circulating in low-resource settings across Indonesia. However, the inaccuracies in Nanopore-generated consensus sequences mean that the approach may not be appropriate for higher resolution transmission studies, particularly when more accurate sequencing technologies are available.
Translated Descriptions
⚠️
This is an automatic machine translation with an accuracy of 90-95%
Translated Description (Arabic)
يصيب فيروس حمى الضنك (DENV) مئات الآلاف من الأشخاص سنويًا في إندونيسيا. ومع ذلك، فإن بيانات تسلسل DENV من البلد محدودة، حيث يجب شحن عينات من تفشي المرض عبر مسافات طويلة إلى مختبرات مجهزة بشكل مناسب ليتم تسلسلها. هذا النهج يستغرق وقتًا طويلاً ومكلفًا ويؤدي في كثير من الأحيان إلى الفشل بسبب انخفاض الحمل الفيروسي أو تدهور جينوم الحمض النووي الريبي. الطرق قمنا بتقييم طريقة مصممة لمواجهة هذا التحدي، باستخدام نهج تبليط PCR متعدد الإرسال "المخطط البدائي" لتوليد أمبليكات قصيرة ومتداخلة بسرعة تغطي منطقة ترميز DENV الكاملة، وتسلسل الأمبليكات على جهاز Nanopore MinION المحمول. تم تقييم بيانات التسلسل الناتجة من حيث تغطية الجينوم ودقة تسلسل الإجماع والتحليل الوراثي. النتائج أثبت النهج المتعدد قدرته على إنتاج تغطية شبه كاملة لمنطقة الترميز من جميع العينات التي تم اختبارها ($\ overline{x }$ x¯= 99.96%, n = 18)، 61% منها لا يمكن تضخيمها بالكامل باستخدام نهج تفاعل البوليميراز المتسلسل الحالي طويل الأمد. تم العثور على تسلسلات إجماع مولدة بالثقب النانوي بين 99.17-99.92 ٪ متطابقة مع تلك التي تنتجها تسلسل Illumina عالي التغطية. يمكن تحسين دقة الإجماع عن طريق إخفاء المناطق التي يقل عمق تغطيتها عن 20 ضعفًا (99.69-99.92 ٪). ومع ذلك، تم تقليل تغطية منطقة الترميز عند هذا العمق ($\ overline{x }$ x ¯= 93.48%). شكلت متواليات إجماع Nanopore و Illumina المتولدة من نفس العينات طبقات أحادية النسل على التحليل الوراثي، وتسلسلات الإجماع الإندونيسية مجمعة بدقة حسب الأصل الجغرافي. ثبت أن النهج متعدد الإرسال وقصير البصيلة متفوق في تضخيم جينومات DENV من العينات السريرية، خاصة عندما كان الفيروس موجودًا بتركيزات منخفضة. كانت دقة متواليات الإجماع الناتجة عن النانوبور من هذه الأمبيليكون كافية لتحديد الأصل الجغرافي للعينات، مما يدل على أن النهج يمكن أن يكون أداة مفيدة لتحديد ومراقبة سلاسل DENV المنتشرة في البيئات منخفضة الموارد في جميع أنحاء إندونيسيا. ومع ذلك، فإن عدم الدقة في تسلسلات الإجماع التي تم إنشاؤها بواسطة Nanopore تعني أن النهج قد لا يكون مناسبًا لدراسات الإرسال عالية الدقة، خاصة عند توفر تقنيات تسلسل أكثر دقة.Translated Description (French)
Résumé Contexte Le virus de la dengue (DENV) infecte des centaines de milliers de personnes chaque année en Indonésie. Cependant, les données de séquence DENV du pays sont limitées, car les échantillons provenant d'épidémies doivent être expédiés sur de longues distances à des laboratoires convenablement équipés pour être séquencés. Cette approche est longue, coûteuse et entraîne souvent un échec en raison de la faible charge virale ou de la dégradation du génome de l'ARN. Méthodes Nous avons évalué une méthode conçue pour relever ce défi, en utilisant l'approche de pavage PCR multiplexe « Primal Scheme » pour générer rapidement des amplicons courts et chevauchants couvrant la région de codage DENV complète, et en séquençant les amplicons sur le dispositif portable Nanopore MinION. Les données de séquence résultantes ont été évaluées en termes de couverture génomique, de précision de la séquence consensus et par analyse phylogénétique. Résultats L'approche multiplex s'est avérée capable de produire une couverture presque complète de la région de codage à partir de tous les échantillons testés ( $ $\overline{x} $$ x¯ = 99,96 %, n = 18), dont 61 % n'ont pas pu être entièrement amplifiés à l'aide de l'approche PCR actuelle à long amplificateur. Les séquences consensus générées par les nanopores se sont avérées être entre 99,17 et 99,92 % identiques à celles produites par le séquençage d'Illumina à couverture élevée. La précision du consensus pourrait être améliorée en masquant les régions en dessous de 20 FOIS la profondeur de couverture (99,69-99,92 %). Cependant, la couverture de la région de codage a été réduite à cette profondeur ( $$ \overline{x} $$ x¯ = 93,48 %). Les séquences consensus Nanopore et Illumina générées à partir des mêmes échantillons ont formé des clades monophylétiques sur l'analyse phylogénétique, et les séquences consensus indonésiennes ont été regroupées avec précision par origine géographique. Conclusion L'approche multiplexe à court-amplicon s'est avérée supérieure pour amplifier les génomes de DENV à partir d'échantillons cliniques, en particulier lorsque le virus était présent à de faibles concentrations. La précision des séquences consensus générées par les nanopores à partir de ces amplicons était suffisante pour identifier l'origine géographique des échantillons, démontrant que l'approche peut être un outil utile pour identifier et surveiller les clades DENV circulant dans les milieux à faibles ressources à travers l'Indonésie. Cependant, les inexactitudes dans les séquences de consensus générées par les nanopores signifient que l'approche peut ne pas être appropriée pour les études de transmission à plus haute résolution, en particulier lorsque des technologies de séquençage plus précises sont disponibles.Translated Description (Spanish)
Antecedentes El virus del dengue (DENV) infecta a cientos de miles de personas anualmente en Indonesia. Sin embargo, los datos de secuencia de DENV del país son limitados, ya que las muestras de los brotes deben enviarse a través de largas distancias a laboratorios adecuadamente equipados para ser secuenciadas. Este enfoque requiere mucho tiempo, es costoso y con frecuencia resulta en un fracaso debido a la baja carga viral o la degradación del genoma de ARN. Métodos Evaluamos un método diseñado para abordar este desafío, utilizando el enfoque de mosaico de PCR múltiplex 'Primal Scheme' para generar rápidamente amplicones cortos y superpuestos que cubren la región de codificación DENV completa y secuenciar los amplicones en el dispositivo portátil Nanopore MinION. Los datos de secuencia resultantes se evaluaron en términos de cobertura del genoma, precisión de secuencia de consenso y mediante análisis filogenético. Resultados El enfoque múltiplex demostró ser capaz de producir una cobertura de región de codificación casi completa de todas las muestras analizadas ( $$ \overline{x} $$ x¯ = 99.96%, n = 18), el 61% de las cuales no pudo amplificarse completamente utilizando el enfoque actual de PCR de amplicón largo. Se encontró que las secuencias consenso generadas por nanoporos eran entre 99.17–99.92% idénticas a las producidas por la secuenciación Illumina de alta cobertura. La precisión del consenso podría mejorarse enmascarando regiones por debajo de 20X de profundidad de cobertura (99.69–99.92%). Sin embargo, la cobertura de la región de codificación se redujo a esta profundidad ( $$ \overline{x} $$ x¯ = 93.48%). Las secuencias consenso de nanoporos e Illumina generadas a partir de las mismas muestras formaron clados monofiléticos en el análisis filogenético, y las secuencias consenso de Indonesia se agruparon con precisión por origen geográfico. Conclusión El enfoque de amplicón corto múltiplex demostró ser superior para amplificar los genomas de DENV a partir de muestras clínicas, particularmente cuando el virus estaba presente a bajas concentraciones. La precisión de las secuencias de consenso generadas por nanoporos a partir de estos amplicones fue suficiente para identificar el origen geográfico de las muestras, lo que demuestra que el enfoque puede ser una herramienta útil para identificar y monitorear los clados de DENV que circulan en entornos de bajos recursos en toda Indonesia. Sin embargo, las inexactitudes en las secuencias de consenso generadas por nanoporos significan que el enfoque puede no ser apropiado para estudios de transmisión de mayor resolución, particularmente cuando se dispone de tecnologías de secuenciación más precisas.Files
s12985-020-1294-6.pdf
Files
(2.1 MB)
| Name | Size | Download all |
|---|---|---|
|
md5:5d5668e0c7a713d5b0e00b4699d933c4
|
2.1 MB | Preview Download |
Additional details
Additional titles
- Translated title (Arabic)
- تقييم تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال والطريقة النانوية لتسلسل فيروس حمى الضنك في إندونيسيا
- Translated title (French)
- Évaluation d'une méthode de PCR multiplexe et basée sur Nanopore pour le séquençage du virus de la dengue en Indonésie
- Translated title (Spanish)
- Evaluación de una PCR múltiple y un método basado en nanoporos para la secuenciación del virus del dengue en Indonesia
Identifiers
- Other
- https://openalex.org/W3006553977
- DOI
- 10.1186/s12985-020-1294-6
References
- https://openalex.org/W1519765314
- https://openalex.org/W1777739215
- https://openalex.org/W1983102293
- https://openalex.org/W2019691939
- https://openalex.org/W2048575064
- https://openalex.org/W2052292847
- https://openalex.org/W2062112818
- https://openalex.org/W2103441770
- https://openalex.org/W2108234281
- https://openalex.org/W2111647009
- https://openalex.org/W2122798427
- https://openalex.org/W2131222241
- https://openalex.org/W2132926880
- https://openalex.org/W2513727910
- https://openalex.org/W2610481301
- https://openalex.org/W2614081736
- https://openalex.org/W2616925143
- https://openalex.org/W2802502040
- https://openalex.org/W2883251903
- https://openalex.org/W2904482307
- https://openalex.org/W2920762429
- https://openalex.org/W2938574745
- https://openalex.org/W2942001335
- https://openalex.org/W2950993016